农杆菌介导禾本科牧草遗传转化的研究进展

张月 李莹 戴绍军

摘  要： 建立禾本科牧草的遗传转化体系对于种质资源利用具有重要意义.近年来，假俭草（Eremochloa ophiuroides）、黑麦草（Lolium perenne）、结缕草（Zoysia japonica）、柳枝稷（Panicum virgatum）、高羊茅（Festuca elata）、二穗短柄草（Brachypodium distachyum）、匍匐剪股颖（Agrostis stolonifera）、朝鲜碱茅（Puccinellia chinampoensis）、羊草（Leymus chinensis）、金发草（Pogonatherum paniceum）、双花草（Dichanthium annulatum）等多种禾本科牧草遗传转化的轉化方法不断得到优化与完善.该文总结了近年来禾本科牧草在遗传转化体系优化的研究进展，探讨了植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对转化效率的影响.

关键词： 禾本科牧草; 遗传转化; 影响因素

中图分类号： Q 939.9    文献标志码： A    文章编号： 1000-5137（2021）01-0021-07

Abstract： The establishment of a genetic transformation system for gramineous forages is of great significance to the utilization of germplasm resources.In recent years，the genetic transformation methods of various gramineous forages such as Eremochloa ophiuroides，Lolium perenne，Zoysia japonica，Panicum virgatum，Festuca elata，Brachypodium distachyum，Agrostis stolonifera，Puccinellia chinampoensis，Leymus chinensis，Pogonatherum paniceum and Dichanthium annulatum have been continuously optimized.This article summarized the recent research progress in the optimization of the genetic transformation systems of gramineous forages，and discussed the effects of plant receptor material，transformation condition，co-cultivation time，acetosyringone concentration，bacteriostatic agent concentration，selection pressure of screening agents and other factors on the transformation efficiency.

Key words： gramineous forage; genetic transformation; effect factors

0  引 言

利用植物转基因技术将目的基因导入植物基因组是改良植物性状的重要方法之一.建立稳定高效的植物遗传转化体系是获得转基因植株的前提.ZAMBRYSKI等[1]以根癌农杆菌Ti质粒为转化载体，将T-DNA上的基因转入烟草细胞，成功获得了第一株转基因烟草（Nicotiana tabacum L.），此后植物遗传转化技术得到迅速发展.植物遗传转化的方法主要包括农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、细胞融合剂介导（PEG）法、电转化法等.与其他方法相比，农杆菌转化法具有易操作、费用低、转化效率高、基因拷贝数低、可转移较大的DNA片段（50 kb）等优点，逐渐成为植物遗传转化最常用的方法.农杆菌介导的转化系统是一种天然的基因转化系统[2]，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可通过植物材料上的伤口进入植物体内并整合到基因组上，经植物有性生殖过程稳定遗传给后代.

由于包括禾本科植物在内的单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，利用农杆菌介导法对其进行遗传转化的研究受到限制[3].HIEI等[4]构建了VlrG和VxB高效表达的超双元载体，通过借助酚类化合物乙酰丁香酮诱导成功建立了水稻（Oryza sativa）遗传转化体系，推动了农杆菌介导单子叶遗传转化的研究进程.通过对转化机理的深入探索，以及对转化方法的不断改进、优化与完善，农杆菌转化法已成为介导禾本科作物的常用手段.近年来，利用农杆菌转化法建立了禾本科重要粮食作物水稻[5]、玉米（Zea mays）[6]、小麦（Triticum spp.）[7]、大麦（Hordeum vulgare）[8]、高粱（Sorghum bicolor）[9]，以及主要糖类作物甘蔗（Saccharum officinarum）[10]等的遗传转化系统，并获得了具有各种优良性状的转基因植物.禾本科植物遗传转化体系的建立为研究植物基因功能、植物发育与逆境应答分子调控机制，以及开展分子设计育种提供了理论依据和技术支撑.

禾本科牧草具有耐践踏、再生能力强的特点，可作为生物燃料、能源作物，以及牲畜的能量饲料和绿化植物.此外，禾本科牧草在草原生态系统中具有水土保持、防风固沙的作用.近年来，随着生物技术的不断发展，国内外转基因牧草研究也取得了明显进展.利用农杆菌介导法建立了禾本科牧草黑麦草[11]、结缕草[12]、柳枝稷[13]、高羊茅[14]、二穗短柄草[15]、匍匐剪股颖[16]等遗传转化体系，获得了具有优良性状的转基因牧草，在牧草改良方面得到了广泛应用.

植物受体材料、转化条件、共培养时间、乙酰丁香酮浓度、抑菌剂浓度、筛选剂选择压等因素对农杆菌介导遗传转化都有一定影响.本文作者将系统介绍各因素对农杆菌介导的禾本科植物遗传转化体系的影响.

1  植物受体的选择

植物受体的选择是影响农杆菌转化的一个重要因素.分裂时期细胞具有分生能力强、生长旺盛的特点，选择分裂时期的组织器官或细胞作为转化受体可获得较高的转化效率，转化后植株的再生能力较强.农杆菌转化过程中，常用的受体材料包括胚性愈伤组织、幼胚、成熟胚、胚芽、茎尖、叶片等.对于不同植物，随最适外植体的选择不同，转化效率也存在明显差异.在假俭草遗传转化体系中，以种质“E126”的侧芽诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，经农杆菌转化后获得了3.6%的转化率[17];农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，将成熟胚诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，获得了4.8%的转化效率[18];柳枝稷遗传转化过程中，利用Alamo品种成熟种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率为6%[19];利用匍匐剪股颖种子诱导的胚性愈伤组织作为受体材料，转化效率高达40%，这暗示着利用胚性愈伤组织作为受体材料的遗传转化转化效率最高[16].此外，茎段具有直接生成不定芽的能力，选择结缕草直接茎段作为受体材料可以获得6.8%的转化效率[20].由此可见，对于禾本科植物而言，选择分裂能力旺盛、细胞活性高、DNA合成能力强的胚性细胞作为受体材料，更有利于农杆菌与T-DNA整合，从而提高转化效率.

2  转化条件及共培养时间

农杆菌介导的遗传转化体系中受体材料的转化条件与共培养时间对转化效率有明显影响.侵染方法不恰当会使农杆菌转化效率降低，侵染时间过短会使农杆菌不能充分依附到受体材料上，导致T-DNA整合效率低，侵染时间过长则容易导致农杆菌过度繁殖，抑菌难度增加，甚至导致受体材料会因农杆菌毒害而死亡.共培养时间影响农杆菌吸附和T-DNA转移[21].农杆菌必须附着在创伤部位16 h以上才能完成转移过程[22].不同作物的最优转化条件与共培养时间存在差异，同一作物不同受体材料的最优转化条件与共培养时间也不同.摸索合适的转化条件与共培养时间是建立高效转化系统所必须的（表1）.

可利用冷处理、搅拌孵育和真空处理等手段提高转化效率.在朝鲜碱茅遗传转化体系建立过程中，使用含有二元载体pBI 121的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化，当菌液在600 nm波长处的吸光度值（OD600）达到0.8～1.0时，对成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡孵育30 min可以达到最佳转化效果[23];对柳枝稷胚性愈伤组织进行遗传转化时，使用含二元载体pCAMBIA 1305.1的根癌农杆菌菌株EHA105，将冷处理20 min后的胚性愈伤组织浸入OD600值为0.5的农杆菌菌液中，经过真空孵育10 min，搅拌孵育20 min，共培养3 d后，其转化效率最高为72.8%[24].这表明：在农杆菌转化前对愈伤组织进行冷处理，可大幅度减少农杆菌侵染后愈伤组织的褐变[25];而转化过程中对愈伤组织进行真空和搅拌孵育对提高转化效率有促进作用，主要因为真空处理可增加愈伤组织表面创伤，使农杆菌更容易进入到愈伤组织内并整合到植物基因组上，搅拌处理则是通过增大愈伤组织与农杆菌的接触面积提高转化效率.

在农杆菌转化前对愈伤组织进行预培养，可改善愈伤组织的生长状态，有利于获得最佳转化效率.在建立羊草遗传转化体系时，使用携带Ib2-Cys prx基因的载体pCAMBIA 2300转化根癌农杆菌菌株EHA105，活化菌液至OD600值为0.4，将预培养7 d后的胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液孵育20 min，最优转化条件为共培养3 d，获得8.97%的转化效率[26].这表明：生长状态良好、分化力强的愈伤组织具有活跃的基因整合能力，明显有利于提高转化效率.

在农杆菌介导的转化过程中，不同受体材料的最适转化条件存在差异.在黑麦草遗传转化体系中，使用农杆菌AGL1转化携带SOS1，SOS2，SOS3，CBL10和BAR基因的耐盐多基因植物表达载体pSOS，将成熟种子诱导的胚性愈伤组织浸泡在OD600值为0.3～0.6的农杆菌菌液中孵育20 min，经2 d共培养后得到22.8%的最高转化效率[27];而在农杆菌介导结缕草匍匐茎节进行遗传转化过程中，将二元载体pCAMBIA 1301，pCAMBIA 1304和pCAMBIA 1305.2导入根癌农杆菌菌株EHA105用于转化，将茎节浸泡在OD600值为1.0的农杆菌菌液中真空孵育10 min，然后浸泡孵育50 min，共培養2 d后，其转化效率最高为10.5%～13.7%[20].

3  乙酰丁香酮浓度

在农杆菌转化植物材料的过程中需要酚类化合物诱导完成，仅靠植物材料自身分泌是远远不够的，需要人为添加.乙酰丁香酮是农杆菌转化单子叶植物过程中常用的酚类化合物.乙酰丁香酮通过诱导农杆菌Vir区VirA基因自身磷酸化，并激活VirG基因产物，从而激活其他Vir基因转录，增强T-DNA加工与转移，使农杆菌T-DNA更容易进入植物基因组并与其整合[28-29].共培养阶段是T-DNA转移和整合的关键时期.

不同植物的遗传转化体系中的乙酰丁香酮浓度存在差异.建立金发草遗传转化体系时，选择物质的量浓度为20 μmol?L-1的乙酰丁香酮加入共培养基中作为最优转化条件[30];结缕草遗传转化体系建立的过程中，在共培养的培养基中添加50 μmol?L-1的乙酰丁香酮达到最大转化率[31].农杆菌介导的黑麦草遗传转化过程中，通过在共培养基中添加200 μmol?L-1的乙酰丁香酮诱导以提高转化效率[11].在农杆菌转化双花草时则选择在共培养的培养基中添加400 μmol?L-1的乙酰丁香酮[32].在柳枝稷、高羊茅和匍匐剪股颖的遗传转化过程中，都选择了100 μmol?L-1作为乙酰丁香酮的最适合物质的量浓度[33-34，16].

4  抑菌劑浓度

共培养后的一个重要环节就是抑菌处理.共培养后受体材料表面及浅层组织中共生有大量农杆菌.为了杀死和抑制农杆菌的生长必须进行脱菌处理，以免影响外植体再生.抑菌剂浓度是遗传转化系统中的一个重要因素.抑菌剂浓度过高会抑制外植体生长甚至造成外植体死亡，浓度过低则起不到抑菌作用.常用的抑菌剂包括特美汀（Tim）、头孢霉素（Cef）和羧苄青霉素（Carb）等.与Cef和Carb相比，Tim对植物材料影响较小，在胚性愈伤组织再生系统中能达到很好的抑菌和再生效果，是组培实验中的首选抑菌剂.在组培过程中，可以根据植物材料受体的特点选择抑菌剂并摸索抑菌剂浓度.二穗短柄草遗传转化过程中，在培养基中添加质量浓度为225 mg?L-1的Tim进行抑菌处理[35];黑麦草遗传转化过程中选择200 mg·L-1的Cef作为最适抑菌剂[11];结缕草遗传转化在抑菌阶段选择250 mg?L-1的Cef进行抑菌处理[36];假俭草愈伤组织的抑菌处理则选择250 mg·L-1的Carb和250 mg?L-1的Cef结合，以达到最好的抑菌效果[37].

5  筛选剂及筛选压选择

在农杆菌介导的遗传转化过程中，只有少数植物细胞能够吸收外源DNA并将其整合到植物基因组中，大多数细胞仍是未被转化的.可以利用质粒载体上带有的特定选择性标记，通过相应的筛选剂筛选被转化的细胞.筛选剂的作用是抑制非转化细胞生长，而对转化细胞无抑制作用，从而保证快速、有效地从大量转化群体中筛选到含有外源目的基因的转化体.不同植物在农杆菌介导过程中所用的质粒载体不同，所以其适用的筛选剂有所差异.不同受体材料对筛选剂的敏感程度和毒害忍耐程度差异较大，并且受体材料在光/暗培养条件下其筛选压也不同.因此，在建立农杆菌介导的植物遗传转化体系中，确定适合的筛选压是基因转化成败的关键[38].在选择筛选压时，要保证在不损伤受体材料的前提下筛选出抗性受体.选择培养过程中，筛选剂会降低受体组织的再生能力，增加褐化率或白化率.所选择的筛选压应该既能有效抑制非抗性细胞的生长，使之缓慢死亡，又不抑制抗性细胞的生长.目前广泛使用的筛选剂包括潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kana）、草酊磷（PPT）等.

在假俭草遗传转化体系中，用带有hpt选择标记基因的pCAMBIA 1301质粒载体进行转化，筛选时愈伤组织的筛选压为质量浓度为100 mg?L-1的Hyg B，阳性芽的筛选压为50 mg?L-1的Hyg B，生根时则不添加Hyg B[37].在农杆菌介导的羊草遗传转化过程中，选择携带npt II抗性基因的pCAMBIA 2300质粒载体进行转化，愈伤组织筛选和再生苗的筛选均选择150 mg?L-1的Kana作为最适筛选压[26].在匍匐剪股颖的遗传转化体系中使用带有bar选择标记基因的pCAMBIA 3301质粒载体进行农杆菌转化，筛选过程中以5 mg?L-1的PPT作为抗性芽的筛选压，10 mg?L-1的PPT作为生根的筛选压[39].

6  结 语

禾本科牧草作为牲畜饲料、绿化植物、生物燃料和能源作物，具有巨大的经济价值和生态功能.利用转基因技术可将禾本科牧草自身不具有的优良外源基因导入植物基因组，实现仅靠传统育种无法实现的遗传重组，定向改造植物遗传性状.农杆菌介导法构建植物遗传转化体系的影响因子很多，不同植物材料的遗传转化条件差异较大.基于基本的农杆菌介导转化机理，不断改进转化方法，提高转化效率，不断建立新物种的转化方法，对于研究禾本科牧草发育与逆境应答机制具有重要意义，也是开展基因编辑分子设计育种的基础.

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（责任编辑：顾浩然）