50种常用香料对铜绿微囊藻的生态毒性效应

张薛薇,开振鹏,宋卫国,陈珊珊（1.上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所,上海 01403；.上海应用技术大学化学与环境工程学院,上海 01418；3.上海市农产品质量安全评价专业技术服务平台,上海 01106）

香料是一类被人们嗅觉或味觉感知的特殊香味的物质.由于具有使人身心愉悦的功能,被广泛应用于食品、饮料、化妆品、洗涤用品、医药、皮革、织物等行业的各类产品中.由于天然香料资源稀少、价格昂贵,以人工合成香料代替天然香料的做法较为流行.随着物质生活水平的不断提高,世界香料产品的消耗量和产量逐年递增.香料也通过生活污水、工业污水系统以及地表径流排放到环境中.许多研究者们曾报道,不仅能够在环境中,如在地表水、污泥、大气及海洋中检测到各种香料残留,在生物体内,如鱼类、海洋哺乳动物,甚至人体组织和母乳中均已检测到香料的残留组分.Simonich等[1]在美国一些主要废水处理厂中的污水发现 16种香料的残留量为0.3～154μg/L.Fromme等[2]在柏林的多条河流和沉积物中均检测到了佳乐麝香（HHCB）和吐纳麝香（AHTN）残留,其中在严重污染区域,残留量为地表水 1.59μg/L,沉积物 0.92mg/kg d.w..除了水体和污泥,Peck等[3]在密尔沃基市南部靠近密西根湖附近收集的空气样本,发现超过 80%的样品中含有合成麝香,其中麝香二甲苯（MX）,麝香酮（MK）为主要污染物.海洋同样受到了合成香料的污染,Vecchiato等[4]在西西里海峡采集了42个海水样本中的27个检测到了合成香料,浓度总和高达 0.112 μg/L.此外,香料可以通过多种途径进入生物体内.不同实验室在鲫鱼、中华鲟等鱼类样品中也检测到了多种合成麝香[5-6],海洋哺乳动物体内也多次检出 HHCB[7-8].早在 1996年,Müller等[9]报道了人体组织中合成麝香化合物的残留.结果表明所有的样品中均检测到合成麝香,其中主要是MK和MX.Moon等[10]收集的43名韩国女性的脂肪组织样品中均检测到 HHCB,浓度范围为 28-211ng/g.Liebl等[11]第一次在母乳中发现合成麝香污染,主要污染物 MX的浓度范围为10～1220ng/g,平均含量为 100ng/g,此后 Kang 等[12]也报道了韩国妇女血清、脐带血清以及母乳样本的合成麝香污染情况.以上研究表明,以合成麝香为主体的香料物质不仅污染水体、海洋、大气环境,也通过食物链最终传递到人体组织及母乳,其污染程度已不容忽视.

尽管人们普遍认为香料对生物体没有明显毒性,但是越来越多的研究发现,香料尤其是合成香料对多种生物的生长有危害.Gooding等[13]研究了AHTN和 HHCB对淡水贻贝幼体的 LC50值在0.5～2mg/L,浓度为1mg/L的合成麝香会导致贻贝幼体生长缓慢.Wollenberger等[14]的研究也发现合成麝香强烈抑制水蚤的幼虫发育.合成麝香对脊椎动物有抗雌激素效应（对人的雌激素受体 EC50值在0.009～0.10nmol/L之间）[15].另外多项实验显示过多人工香料暴露可能增加癌症的发生几率[16].然而,当前香料毒性的研究主要集中在对动物的危害,而对植物和藻类的研究相对匮乏.

铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）是一种广泛分布的淡水蓝藻,它是造成水体水华的重要藻类,是水生生态系统中的初级生产者,作为一类原核生物,铜绿微囊藻对一些污染物更为敏感.而且由于其容易获得、个体小、繁殖快,是一种很好的测试生物[17].许多研究者发现双酚 A,萘、芘、菲,生长素吲哚乙酸等各种有机污染物暴露可对铜绿微囊藻生长产生影响,表现为不同浓度下产生促进或抑制作用[17-19].朱小琴等[20]评价了酚酸类,生物碱类,脂肪酸和酯类共13种化感物质的抑藻效应.结果表明,生物碱类物质对微藻生长的抑制效果最强,其抑制率＞80%.以往这些研究的目的多集中于各类化合物在湖泊富营养化过程中的作用或者化感控藻,进而完成水华控制相关的机理研究,并未以铜绿微囊藻为指示性藻类而研究水体中存在的某一大类污染物对其的生态毒性.因此,本实验以铜绿微囊藻为受试对象,重点研究 50种常用香料对其生长的影响、叶绿素、蛋白质浓度、抗氧化损伤酶活力等生理指标的变化,丰富香料的毒性数据,以期为全面评估香料的生态环境风险和科学使用香料提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 实验仪器和材料

仪器:紫外-可见光分光光度计（UV1901）,冷冻高速离心机（Centrifuge 5804R）,超声波细胞破碎仪（JY92-IIDN）,酶标仪（Multiskan FC）,高压蒸汽灭菌锅（LDZH-200KBS）,电子分析天秤（XS 105DualRange）,光照培养箱（SPX-300B-G）.

本实验所用铜绿微囊藻FACHB 905购于中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库.实验前在BG11培养基扩大培养备用.在无菌条件下,在250mL的锥形瓶中各加入10mL备用藻液和不同含量的香料,最后加入无菌培养基,使培养液总体积为100mL.将接种后的培养基置于无菌光照培养箱中,设置光照强度为 3200lx,温度（28±0.5）℃,光暗比12h:12h,每日早中晚摇动锥形瓶,并随机更换位置,防止因光照不均匀带来影响.

50种供试香料化合物均购于梯希爱（上海）化成工业发展有限公司,纯度＞96%（详见表 1）.分析纯试剂乙醇、二甲基亚砜（DMSO）等购自上海安谱科学仪器有限公司.根据化合物的理化性质和溶解度,分别将各供试香料用上述溶剂溶解,配制成浓度为100mg/L的母液.超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）以及丙二醛（MDA）测定所用的试剂盒购自南京建成生物工程研究所.

1.2 实验设计

向实验组中分别加入表1中50种香料化合物,使各实验组每个锥形瓶中化合物浓度为 0.01,0.05,0.1,0.5,1,5,10mg/L,每组设置5个平行.同时设置不添加香料的对照组,按上述培养条件培养.以9d为实验周期,每日测定藻密度.

表1 50种香料对铜绿微囊藻生物量增长的抑制率（浓度1mg/L）Table 1 Inhibitory rate of 50kinds of fragrance materials on biomass growth of M.aeruginosa at 1mg/L

续表1

1.3 指标测定

实验选取了对铜绿微囊藻的生长有显著抑制作用的4种香料2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚,分别于第3、6、9d时测定叶绿素a、蛋白含量和抗氧化酶活性.这 4种化合物的处理浓度为 1mg/L,每组设置5个平行.设置不添加香料的为空白对照组.

1.3.1 铜绿微囊藻生长测定 每隔24h使用紫外-可见光分光光度计,于OD680处检测各处理组和对照组藻培养液的吸光度,连续检测 9d.利用预先测定的藻细胞浓度与吸光度值的相关公式计算微囊藻细胞浓度:

式中:Y为藻细胞数量,106个细胞/mL; X为680nm处的光密度值OD.

1.3.2 叶绿素a含量测定 分别在第3、6、9d于各处理组和对照组藻培养液中取5mL藻液,10000r/min离心10min收集藻细胞,加入5mL 95%乙醇,置于 4℃冰箱黑暗提取 24h,将提取液离心（10000r/min,10min）,取上清液,以95%乙醇作为参比,以665、649nm 下的吸光值计算叶绿素含量.运用以下公式计算叶绿素a的浓度[21]:

1.3.3 粗酶液提取和蛋白质含量测定 在实验的第3、6、9d于各处理组和对照组藻培养液中取5mL藻液,10000r/min离心 10min,收集藻细胞,加入0.01mol/L的磷酸盐缓冲液（PBS）重悬,4℃细胞破碎仪超声 5min.细胞完全破碎后,将样品在 4℃下10000r/min离心10min,取上清液使用酶标仪测定样品中蛋白质含量.铜绿微囊藻的蛋白质含量测定采用修正的Bradford法[22].

1.3.4 抗氧化酶活性和丙二醛含量测定 利用1.3.3中提取的粗酶液测定抗氧化酶活性.SOD的活性采用羟胺法测定;POD利用愈创木酚法测定;CAT的测定运用钼酸铵比色法;MDA采用硫代巴比妥酸TBA比色法测定.以上测定均采用试剂盒完成.

1.4 数据处理

所有实验数据结果均采用mean±SD的形式表示,运用GraphPad prism 6软件进行数据分析及单因素方差分析（One-way ANOVA）.

2 结果与讨论

2.1 香料对铜绿微囊藻生长的影响

实验结果显示在测试浓度下（0.01～10mg/L）大部分香料对铜绿微囊藻的生物量增长（以细胞数计算）均没有显著影响.但是在高浓度下,2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚显著抑制铜绿微囊藻的生长,这4种香料处理组表现为实验4d后藻细胞浓度显著低于对照组.本实验以培养第9d的藻细胞浓度计算不同香料在不同浓度下的抑制率.表 1显示 46种香料在1mg/L的浓度下对藻的抑制率均低于20%,而2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚的抑制率分别为58.82%、62.09%、79.58%和56.91%.实验还发现,在处理浓度1mg/L下橙花叔醇、肉桂醇、胡椒酮等对铜绿微囊藻的生长有一定的促进作用,但不显著.依据不同浓度下生物量增长的抑制百分率,计算出2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚对铜绿微囊藻的生物量增长抑制率半效应浓度 EyC50值分别为1.81,1.26,0.55,1.40mg/L.

为了进一步研究香料对铜绿微囊藻的毒性,实验测定了有显著抑制作用的4种香料（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）对铜绿微囊藻叶绿素a、蛋白质浓度和抗氧化损伤酶活力等生理指标的影响.

2.2 香料对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响

实验在第3、6、9d时分别测定了1mg/L的4种香料（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）对叶绿素a含量的影响.图1显示,2-甲氧基萘和麝香草酚显著抑制铜绿微囊藻叶绿素 a的含量（P＜0.0001）;月桂烯能抑制叶绿素 a含量,但抑制能力没有 2-甲氧基萘和麝香草酚显著（P＜0.01）;吲哚对叶绿素a的含量无影响（P＞0.05）.2-甲氧基萘和麝香草酚对叶绿素a的抑制率随处理时间的延长没有明显变化,处理 3d至 9d的抑制率分别在 45%～50%和60%～70%.月桂烯处理的铜绿微囊藻3d时叶绿素a的抑制率为52.36%,然后叶绿素a的含量持续升高,在第 9d时抑制率为 11.96%.叶绿素作为光合色素,在藻类光合作用中起关键性作用,参与光合作用中光能的吸收、传递和转化.2-甲氧基萘和麝香草酚对铜绿微囊藻光合活性的影响主要体现在影响胞内光合色素的合成,从而影响了藻细胞对碳的固定和同化,导致光能利用效率和转化效率下降,藻类的光合速率降低,最终对微囊藻造成生长抑制,并且随着时间的推移抑制率略有升高.

图1 香料对铜绿微囊藻叶绿素a含量的影响Fig.1 Effects of fragrance material on chlorophyll a content of M.aeruginosa

2.3 香料对铜绿微囊藻蛋白质含量的影响

由图2可见,与对照组相比,1mg/L 的2-甲氧基萘和麝香草酚显著抑制铜绿微囊藻蛋白质含量（P＜0.0001）;并且随着时间的推移,抑制作用没有减弱.月桂烯和吲哚在第3d时有较强的抑制作用（P＜0.01）;但到了第9d,这种抑制作用就不显著了（P＞0.05）.可见随着暴露时间的增长,月桂烯和吲哚处理的铜绿微囊藻蛋白质含量逐渐回升.这可能与生物体补偿机制有关.在香料的胁迫下,铜绿微囊藻蛋白质合成可能受到抑制,或者香料使得合成的蛋白质降解.实验结果也显示不同的香料影响了藻细胞蛋白质合成和代谢不同的位点,使得不同香料呈现出不同的毒理效应.这一结果与金霉素及其异构体降解产物对斜生栅藻可溶性蛋白质的影响类似[23].

2.4 香料对铜绿微囊藻抗氧化酶和丙二醛含量的影响

活细胞中自由基的浓度升高会导致动物衰老,癌症的发生和免疫缺陷以及细胞膜渗漏,衰老,叶绿素被破坏等.与动物相似,植物具有强大的酶防御系统来处理异生素.植物中的酶促防御包括能够去除、中和氧中间体的酶,涉及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等.浓度 1mg/L香料暴露下第 3d,铜绿微囊藻 SOD、POD和 CAT活性与空白对照并无显著差异;至第6和9d时,不同香料暴露呈现出酶活性的变化.香料对铜绿微囊藻的生物量增长的抑制也呈现类似的现象,可见抗氧化酶活性的下降与铜绿微囊藻生长抑制相关.由图3a至图3c可知,2-甲氧基萘暴露导致SOD活性显著降低（P＜0.0001）,其它两种抗氧化酶则无显著影响（P＞0.05）;麝香草酚显著抑制了POD活性（P＜0.0001）;月桂烯也可降低 SOD 活性（P＜0.01）;经吲哚处理的铜绿微囊藻,POD和 CAT的活性显著低于对照组（P＜0.0001）.由于化合物结构差异,不同的香料会影响藻细胞中不同的抗氧化酶,进而干扰胞内正常的生理代谢水平.该结果与金霉素及其异构体降解产物对斜生栅藻抗氧化系统的不同影响类似[23].

MDA是一种在逆境胁迫下产生的脂质过氧化产物,其含量可指示细胞膜脂过氧化水平,并作为藻体受胁迫程度的标志.由图 3（d）可知,4个处理组MDA 含量均高于对照组（P＜0.05）.对照组的含量为1.68～1.85nmol/g,而处理组 MDA 含量在 2.10～2.22nmol/g之间.该结果证实了经上述4种香料暴露的藻细胞内产生了氧化应激的变化.香料会破坏抗氧化酶防御系统,使抗氧化酶的合成受到抑制,细胞内过量的活性氧（ROS）无法及时排除,诱导细胞膜发生膜质过氧化作用,引起 MDA 大量积累,最终导致死亡.

2.5 香料对铜绿微囊藻生长影响机理初探

具有强烈的类似橙花香气的 2-甲氧基萘被广泛用于香皂、花露水和古龙香水.在本实验条件下,2-甲氧基萘显著抑制了微囊藻叶绿素a和蛋白质含量,降低了SOD酶的活性.在原核细胞和叶绿体中主要存在Fe-SOD,它们可以有效地清除超氧阴离子自由基,避免对细胞过度的损伤,维持叶绿体功能.因此,我们推断2-甲氧基萘可能是通过抑制SOD酶活性,影响了微囊藻叶绿素 a和蛋白质含量,进而抑制了微囊藻的生长.本文研究结果与王秀翠等[19]报道的2-甲氧基萘类似物萘的暴露能显著降低铜绿微囊藻叶绿素 a含量,最终抑制藻类生长的结果一致.本实验中麝香草酚也可能是通过抑制POD的活性,影响了微囊藻的光合作用,导致藻类的死亡.沈青山等[24]研究表明高浓度的麝香草酚可以诱导黄曲霉孢子生产大量的ROS和NO达到杀菌效果,与本实验麝香草酚破坏藻类抗氧化酶防御系统,产生氧化应激反应的现象类似.从实验结果可以看出月桂烯也可以抑制SOD酶活性,使得藻细胞积累大量ROS,使叶绿素的浓度降低,影响藻细胞的光合作用,最终引起藻类死亡.与上述 3种香料不同,吲哚对铜绿微囊藻叶绿素 a的含量没有显著影响,它主要是抑制了POD和CAT酶的活性,导致细胞内ROS的大量积累,引起藻类死亡.Lee 等[25]发现吲哚通过调控传感器蛋白 SidA,影响 SidA介导的一系列转录,下调抗酸性基因表达,抑制大肠杆菌生物膜形成.而内源性氧化胁迫也会抑制大肠杆菌细胞膜的形成[26].因此,我们推断高浓度的吲哚可以抑制藻的抗氧化酶活性,使得藻细胞积累大量ROS,影响生物膜形成,达到抑制铜绿微囊藻生长的效果.不同的香料对铜绿微囊藻的作用机理存在差异,但是这 4种香料都能破坏微囊藻的抗氧化酶系统,导致细胞内ROS大量累积,进而抑制藻类生长.不同的是,2-甲氧基萘、麝香草酚和月桂烯可能是抑制了藻类光合作用;吲哚可能是干扰了细胞膜的形成.2-甲氧基萘、麝香草酚和吲哚属于芳香族化合物,月桂烯为烯烃类化合物,不同结构的香料对不同的抗氧化酶活性的影响也不一样.

当前人们普遍认为大部分香料对生物体没有毒性或毒性较低,而香料对植物的影响也少有人关注.本研究表明部分香料可以通过抑制藻细胞抗氧化酶活性,破坏叶绿素含量和功能,进而导致藻类生长异常.环境中香料残留的来源主要是生活和工业污水.现行污水处理并没有考虑到去除其中可能的香料残留[27].某些香料（如多环麝香等）属于持久性有机污染物,环境中难降解,容易产生生物富集.研究发现国内人口密度高的大中型城市河流沉积物中多环麝香污染相当严重,城市污泥中（干物质量）残留量达到769mg/kg[27],污水中残留量为0.005～0.55mg/L[27-28].本实验发现在50种常用香料中有4种（2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚）对铜绿微囊藻的生长有显著的抑制作用.由于在食物链底端的藻类对整个生态系统起着至关重要的作用,因此香料对藻类的影响也应该受到关注.

3 结论

3.1 尽管本文所研究的50种香料大部分对铜绿微囊藻的生长没有显著影响,但是实验发现 2-甲氧基萘、麝香草酚、月桂烯和吲哚在 1mg/L暴露浓度下能显著抑制铜绿微囊藻的生长,并表现出明显的剂量-效应关系,EyC50值分别为 1.81,1.26,0.55,1.40mg/L.

3.2 这4种香料通过抑制藻细胞抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性,过量累积MDA,破坏叶绿素含量和功能,进而导致藻类生长异常.不同结构的香料影响不同的抗氧化酶活性.其中2-甲氧基萘、麝香草酚和吲哚均属于芳香族化合物.作为香料中的一大类芳香族化合物,由于具有独特的芳香气味,被广泛应用.但是芳香环性质稳定、难降解,对环境藻类有潜在危害,因此我们需要更多关注芳香类香料的生态安全性.