二氯乙腈对大肠杆菌基因表达的影响

2021-03-30任杰辉西安理工大学西北旱区生态水利国家重点实验室陕西西安710048

中国环境科学 2021年3期

李冬,程文,秦璐,任杰辉,郑兴（西安理工大学,西北旱区生态水利国家重点实验室,陕西西安 710048）

饮用水消毒是饮用水安全的重要保障,避免了霍乱、痢疾和伤寒等常见疾病的扩散传播[1].然而,随着消毒工艺的进步与发展,消毒后产生了许多种类的消毒副产物（DBPs）,研究发现多种癌症（如结直肠癌、膀胱癌等）的发生与通过饮用水接触DBPs直接相关[2].因此,深入研究并控制饮用水消毒后产生的DBPs,对居民饮水健康具有重要价值.

消毒副产物主要包括三卤甲烷、卤乙酸、卤乙腈、亚硝胺等类物质,这些物质常常存在于消毒后的饮用水中.相关研究[3-4]指出饮用水中检出 700余种DBPs,对人体健康存在潜在危害,但仅有一少部分DBPs受到监管或规范,如三卤甲烷及卤乙酸.因而,掌握各类DBPs的危害及毒性作用,对DBPs的管控具有重要价值.近年来由于含氮废水排放及氯胺消毒使用的增加,含氮消毒副产物（N-DBPs）逐渐在饮用水中被检出.已有研究[5-6]表明 N-DBPs比含碳消毒副产物（C-DBPs）具有更强的三致效应,因而促使N-DBPs备受关注[7-9].卤乙腈类消毒副产物（HANs）是最常检测到的 N-DBPs[10],也是供水中已知的 10种DBPs中最有害的,占总毒性的45-83%[11].二氯乙腈（DCAN）作为一种典型的 HANs,与大多数N-DBPs相比,因其具有在水处理厂中检出率高[12]、含量高[13]、致癌致畸性强等特点,逐渐受到广泛关注.目前的研究中发现 DCAN会诱导小鼠皮肤产生肿瘤,甚至导致小鼠 DNA 损伤加剧细胞凋亡[14-15];使中国仓鼠卵巢细胞密度降低及 DNA损伤[16].然而,关于 DCAN暴露的毒理学特性研究较少,导致对DCAN管控的研究受到限制.

目前的毒性检测一般是以诱导损伤检测为主,包括Ames试验、染色体畸变试验、体外彗星试验、内源基因突变,以及啮齿动物和水生生物体内致癌性生物实验[17-22].而大多数体外检测只检测单一类型的损伤,提供细菌或其他生物体经历的整体性生理变化信息非常有限;体内检测方法操作繁琐、检测周期长、有违 3R（减量化、再利用、再循环）原则,所以利用高通量和耗时短的分析方法来评估大量环境污染物的毒性更加迫切.近年来以高通量技术为研究手段的毒理基因组学不断发展为环境污染物的毒性评估提供了新的研究工具[23],使研究人员能够在特定条件下,对环境污染物在基因水平上的毒性作用进行较为全面的分析.因其可对环境应激源暴露作出应答,具有速度快、高通量等优势被广泛应用[24].

本研究采用以毒理基因组学为基础的实时基因表达谱方法,将 DCAN作用于特定 E.coli,对其所诱导的应激反应进行分析,探究其毒理作用的基因机制,为研究其对人类健康可能产生的直接或间接毒性作用提供新思路.

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

DCAN（纯度 98%+,上海阿拉丁生化科技股份有限公司）,M9低盐培养基（浓度:5×,上海瑞楚生物科技有限公司）,二甲基亚砜（DMSO,分析纯,广东省化学试剂工程技术研究开发中心）,全自动移液工作站（epMotion 5075t,德国Eppendorf AG）、微孔板细胞成像系统（Cytation5,USA Bio-Tek）.DCAN 不溶于水,用0.01% DMSO 作助溶剂.因在最大耐受浓度研究中,以DMSO为空白对照,考察了对菌株基因表达的影响,故将DMSO浓度设定为0.01%,确保对实验结果无影响.

1.2 实验受试菌株

研究中采用的菌株为绿色荧光蛋白（GFP）转染的大肠杆菌基因文库（菌株）,E.coli K12,MG1655（含低拷贝质粒pUA66或pUA139、卡那霉素抗性基因及快速折叠的gfpmut2基因）包含不同的应激反应基因启动子[25].

1.3 实验方法

以 DCAN在水中的最大溶解度为上限浓度进行预实验,测定其生长抑制情况（OD600）,确定细胞存活率≥95%时的浓度,即最大耐受浓度（EC5）为1.429×10-3mg/L,以EC5为实验浓度上限依次向下稀释10倍进行实验研究.

菌株置于96孔板中培养,37℃条件下静止过夜培养;以1×M9培养基将菌液按体积比1:5稀释,转接至 384孔板;将 384孔板中的菌液在 37℃下培养5～6h,使光密度 OD600[26-29]达到早期指数生长阶段（OD600读数约0.2）;培养后的384孔板中添加不同浓度的DCAN;为了测定DCAN诱导的基因转录水平效应,将 384孔板置于微孔板细胞成像系统中,同时测量光密度（OD600,细胞生长）和荧光读数（GFP水平,Ex:45nm,Em:528nm）,以 2h为暴露时间,每 5min测定读数,实验设置3组平行样.

1.4 实验数据处理

以5次移动平均法处理GFP和OD数据,然后采用对照组进行校正.将GFP信号归一化,以P=GFP/OD计算,并分别在暴露于和未暴露于DCAN的情况下对背景进行校正（不含GFP的E.coli菌株）.基因表达的改变,也被称为诱导因子 I[21],以基因在化学样品暴露的实验条件下及在没有任何化学样品暴露的对照条件下的比率表示.采用每个时间点I的自然对数ln I进行进一步数据分析,ln I值:中性=0、上调＞0、下调＜0.同时,通过整合诱导因子 I随时间变化来计算转录效应水平指数（TELI）,用于量化DCAN存在下基因表达水平的改变,指示给定基因在一定暴露期内的累积转录效应[30-31],通过识别和分析与特定应激反应途径相关的基因变化,探究DCAN的毒性作用模式.

1.5 自组织映射（SOM）分析

SOM 常用于基因表达数据的探索性分析,目前已被有效地用于共表达基因组的发现或化学物质的分类研究中[32].为从浓度-时间-基因三维数据集中发现具有相似表达水平的基因,识别 DCAN的毒性作用模式,采用微阵列软件套件 MeV 4.9[33]进行SOM分析及可视化,参数设置如表1所示.

表1 SOM分析参数设置Table 1 Parameter setting of SOM analysis

1.6 DCAN毒性终点确定

转录效应水平指数（TELI）是最近开发的毒理基因组学数据解释指数,且与表型毒性研究中所采用的终点指标存在一定的相关性[29].TELI值分析方法考虑到化合物暴露导致的表达改变基因的数量、特性、程度及时间序列,可以确定单个基因或代表特定途径或整个应激反应的变化,故采用TELI值为基础的数据拟合剂量-反应曲线,进行分子毒性终点的推导.在毒理基因组学中,以TELI值法表示的基因表达水平达 1.5时的浓度用 TELI1.5表示,反映了亚急性毒性中毒性作用的最低浓度,故采用graphpad Prism 5.0软件以四参数非线性回归模型拟合TELI剂量-效应曲线,由此得出各应激途径的毒性终点TELI1.5.

2 结果与讨论

2.1 DCAN对E.coli实时基因表达的影响

通过在6个浓度梯度的DCAN中暴露E.coli菌株120min的实验方法,获得时间及浓度两个维度下的基因表达谱,结果如图 1所示,图中提供了有关各种应激反应途径和功能基因的详细表达信息,根据应激基因的主要功能和参与的不同应激机制程度分为5个功能组,包括DNA应激（含SOS反应）、氧化还原应激（含解毒和氧化还原平衡）、蛋白质应激、膜（脂质应激和膜转运体）和普通应激[15].从图谱中可以看出,DCAN的基因表达谱较为复杂具有动态性,随时间及浓度不同,不同基因产生了不同的表达结果,如otsB在1.429×10-4mg/L时表达上调趋势明显,为正向调控;低浓度暴露促进了 mutS的表达;uvrY在不同浓度中表达水平不断变化;motA在所有浓度中都呈现出上调趋势;而 umuD仅在最高实验浓度中表达上调趋势明显;其他一些基因表达呈现出短时效应及延迟效应.图谱中还显示大多数普通应激基因表达呈上调趋势,说明 DCAN暴露过程中对细胞内的稳态环境可能产生严重干扰;与其他类型应激相比,大部分与DNA应激相关的基因表达水平变化比较明显,这些基因表达水平变化可能与生物体内多个基因的激活和信号通路变化相关.

图1 DCAN暴露下E.coli菌株的实时基因表达谱Fig.1 Real-time gene expression profile of E.coli exposed to DCAN

2.2 DCAN对E.coli毒性作用分析

采用SOM聚类方法,根据基因的时间表达模式识别出9类基因簇（图2a）.第I类包含基因数目达35个,约占总基因数的32%,且多与DNA损伤及氧化还原应激相关,基因表达呈下调趋势;而第Ⅳ类基因则在 40min后从中性状态转变为下调状态;DCAN暴露下,第Ⅴ与Ⅵ类中的基因并未产生表达改变.与其他基因簇相比,第Ⅸ类有 28个与普通应激、膜及DNA损伤应激相关的基因均处于上调状态.与对照组相比,参与DNA修复的SOS系统中uvrA、ybfE、nfo和sbmC等基因表达水平较高,属于上调基因,其中 uvrA是检测损伤并启动下游内质网级联反应的关键蛋白,优先与受损DNA结合[34],修复多种DNA病变过程,与核苷酸切除修复（NER）途径相关,它的过度表达表明它在修复各种各样的损伤中起着积极的作用;核酸内切酶nfo在双脱氧核糖核酸中催化单链断裂,参与碱基切除修复（BER）,它的上调表明DCAN暴露使DNA链发生断裂,同时nfo基因对过氧化氢和其他活性氧（ROS）等氧化剂有反应,说明DCAN通过氧化应激进而诱导 DNA损伤的发生.RecE是E.coli经典RecET重组系统的一部分,与游离的双链DNA（dsDNA）末端结合,采用与I型外切酶类似的机制,过程性消化 dsDNA,从而使受损DNA链的核苷酸重新定位在活性位点内的50′末端链上[35],对DNA进行修复,RecE表达上调同样说明DCAN会促进E.coli DNA损伤.SOM分析中存在多个 DNA修复相关基因的启动子活性改变表明DCAN引起DNA损伤,该结果与之前的研究结果一致[15,36-37].Lipscomb等[38]和 Ahmed 等[39]的研究也指出DCAN会诱导DNA链断裂,进而造成了DNA损伤.在DCAN暴露下SOS应急系统中的基因也存在表达抑制的情况,但并不是所有的 SOS基因都参与生理性 DNA 修复途径[40].因此,其对不同基因毒性的参与和活性有待进一步研究.

图2 DCAN的SOM图Fig.2 The SOM diagram of DCAN

除SOS应急基因外,22个与其他应激相关的基因包括耐药/敏感基因、普通应激基因和解毒机制基因在 DCAN暴露条件下呈上调趋势,其中耐药基因cmr（又称 mdfA）,是转运蛋白超家族（MFS）的成员,其产物是一种多药外排蛋白,其过度表达可导致广泛化合物的耐药性;motA与鞭毛合成和运动功能有关,其表达改变会影响 E.coli代谢功能;emrA、sbmA、sanA、pbpG与膜转运蛋白及排泄有关,cls涉及细胞膜及磷脂的合成.上调基因中还包括氧化还原应激中的inaA、yeaE、trxC、trxA基因,yeaE、trxC、trxA与解毒机制相关,DCAN暴露触发了解毒机制,表明氧化还原应激是重要的毒性作用模式,Esmat等[15]的研究发现 DCAN存在条件下通过氧化应激及神经退行性病变进而对胎鼠脑组织产生不良影响.与细胞死亡有关的 slyA表达也表现出上调趋势,基因cyoA在40min后表达呈下调趋势,说明DCAN的存在干扰了电子传递可能影响细胞内 ATP水平,对能量代谢产生影响.许多与普通应激相关的基因在DCAN暴露中存在过表达的情况,表明细胞生物化学和物理稳态可能受到干扰,但在现有研究中未发现相关报道,表明普通应激可能是 DCAN潜在的毒性作用模式.其他功能基因暴露在 DCAN中表达水平发生了改变,说明 DCAN对其他类型的应激反应也存在一定影响.

2.3 DCAN毒性终点确定

剂量是决定外源化学物对机体造成损害作用的主要因素之一[41],剂量的多少决定了毒性的强弱.因此,为了获取DCAN定量分子毒性终点,采用TELI值法对不同功能基因的表达水平进行计算,获得了不同浓度下不同途径应激反应的毒性变化,结果如表2所示,发现DNA应激及普通应激的TELI值随浓度增大呈增加趋势,表明毒性随浓度增加而增加,但在其他应激反应中没有呈现较好相关变化趋势.为进一步探究浓度与毒性作用的关系,采用四参数非线性回归模型拟合了DCAN 6个浓度梯度的剂量-效应关系曲线,拟合结果如图3所示.不同应激反应表现出特征性的“S形”曲线或“S形”曲线的一部分.该研究结果与以剂量的对数对药效作图,多呈 S型曲线的理论[42]相一致.从剂量效应曲线中可以观察到 DNA损伤是 DCAN诱导的主要毒性作用模式,该结果与SOM分析结果一致.在DCAN最低浓度暴露下,DNA损伤非常明显,其他各类型应激反应变化水平呈现氧化还原应激＞普通应激＞膜应激＞蛋白质应激的趋势,说明普通应激和氧化应激损伤也是DCAN诱导的重要毒性作用模式.这些结果均表明DCAN对重组基因的大肠杆菌存在潜在毒性作用.

表2 DCAN暴露下不同应激反应毒性变化Table 2 Toxicity changes of different stress responses to DCAN

图3 基于TELI值的DCAN剂量-效应曲线Fig.3 Dose-response curves of DCAN based on TELI values

通过实验分析及模型计算得到DCAN的不同应激反应类型毒性终点,结果如图4所示（因普通应激拟合后数据范围较为宽泛,无法得出TELI1.5具体数据值）.从图中可以看出,DNA 应激的 TELI1.5为6.54×10-9mg/L,与其他应激反应的 TELI1.5相比数量级最小,浓度小而产生的基因表达水平与其他应激基因表达一致,说明 DNA损伤是主要的毒性作用模式.