产气荚膜梭菌ε毒素研究进展

朱 真，郭 鑫，杜吉革，李启红，黄小洁，李倩琳，印春生，陈小云*

(1.中国兽医药品监察所，北京 100081；2.中国农业大学，北京 100094)

产气荚膜梭菌(C.perfringens)旧称魏氏梭菌(C.welchii)或产气荚膜杆菌(Bacillusperfringens)，1891年，由医学博士Wlliam H.Welch和同事进行尸检时发现。它是一种重要的人畜共患细菌性传染病病原，广泛存在于土壤、污水、食物等自然环境以及动物及人类的肠道中。作为条件致病菌，能引起多种动物，包括绵羊、山羊、牛、猪、禽类、犬、家兔、驯鹿、羊驼等坏死性肠炎、肠毒血症，并能导致人的气性坏疽和食物中毒。菌体自身不致病，依靠其分泌的外毒素造成机体损害，主要分泌α、β、ε、ι 4种外毒素，此外还有CPE、NetB、PFO、TpeL等其他毒素，而根据毒素产生种类的不同，该菌可分为A、B、C、D、E、F、G 7个型[1-2]。其中A型菌主要分泌α毒素，可导致人类气性坏疽和食物中毒，也可引发动物气性坏疽和肠毒血症；B型菌主要分泌α、β和ε毒素，是羔羊痢疾和其他反刍动物坏死性肠炎的罪魁祸首；C型菌主要分泌α毒素和β毒素，是绵羊猝狙的病原；D型菌主要分泌α毒素和ε毒素，可引发动物肠毒血症；E型菌在各型中较少见，主要分泌α毒素和ι毒素，可致犊牛、羔羊肠毒血症；F型菌主要分泌CPE毒素，可致人类食物中毒和抗生素相关性腹泻；G型菌分泌NetB毒素，主要引起鸡坏死性肠炎[2]。所有外毒素中ε毒素毒力最强，对小鼠的LD50可达100 ng/kg。本文通过致病机理、病理变化、流行特点以及相关疫苗研究方面对产气荚膜梭菌ε毒素最新研究进展进行梳理，以期为产气荚膜梭菌病的防控提供参考。

1 致病机理及病理变化

ε毒素主要由B型和D型产气荚膜梭菌分泌，其对小鼠的LD50为100 ng/kg，在该菌所有外毒素中毒力最强，也是继肉毒梭菌毒素和破伤风毒素之后的世界第三大毒力细菌外毒素，被美国疾病预防控制中心(CDC)列为B类生物制剂。该毒素全长296个氨基酸，大小为32.9 ku，以毒素前体的形式分泌于菌体之外[3]。编码ε毒素的基因位于质粒，目前已发现至少5种质粒存在该基因，其中至少2种质粒可接合转移，这样的特征使得毒素基因能在物种内水平转移，从而导致毒力因子的变化[4]。毒素前体被宿主分泌的胰蛋白酶、糜蛋白酶或梭菌自身分泌的γ蛋白酶作用后，去除N端11个～13个及C端22个～29个氨基酸，不同酶切除氨基酸的数量略有差异，但都能使的毒素前体活化为成熟毒素。对ε毒素敏感的细胞不多，大多为肾源细胞，其中以MDCK细胞最为敏感，ε毒素可损害其细胞屏障完整性，通过激活PLC-y1磷酸化导致Ca2+流入[5]。其他敏感的细胞还包括小鼠肺内皮细胞系(1G11)[6]、豚鼠腹膜巨噬细胞(GPPM)、高加索人肾平滑肌母细胞瘤细胞(G402)、小鼠肾皮质收集管细胞(mpkCCDc14)、人肾小管上皮细胞(HRTEC)及人肾腺癌细胞(ACHN)[4]，也有研究发现ε毒素能引起大鼠甲状腺上皮细胞系(FRT细胞系)死亡[7]。

ε毒素分子主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3个区域，结构域Ⅰ的功能十分重要，决定毒素与细胞受体结合过程；结构域Ⅱ内有膜插入位点，与毒素蛋白质的多聚化以及维持细胞受体结合稳定性有关；结构域Ⅲ包含C端部分，在细胞膜穿孔过程中发挥着重要作用。ε毒素属于成孔毒素的气溶素家族，同属于该家族的还有腐败梭菌的α毒素等，该家族毒素氨基酸无同源性，但蛋白结构具有相似性。毒素作用的微观模式主要为ε毒素被酶活化后与受体结合，定植于细胞膜上的脂筏，并在该区域引发低聚反应，形成大小155 ku～220 ku的蛋白复合物，复合物进一步发展为七聚体后，在膜的相同位置被组装，形成孔道。而在这过程中，一种双β桶状结构对成孔过程至关重要[8]，孔形成后可允许离子和分子通过[4]。而其宏观模式即是致病菌在肠道定植后，直接破坏血管和肠壁，使其渗透性增加，打破机体液体环境的稳态平衡，引发反刍动物的肠毒血症，继而毒素从肠道进入血液循环，作用于肾、肺和血管内皮细胞，穿过血脑屏障损伤神经系统，致突发死亡[4]。小鼠毒性试验表明，毒素能在脑、肾、肺、脾、心脏中积累并致多脏器损伤，在肠道中主要结合于结肠部位[9]。ε毒素对脑组织的作用十分复杂，通过作用于内皮细胞管腔表面和淋巴细胞的受体——髓磷脂和淋巴细胞蛋白(MAL)介导血脑屏障的通透性[10]，此外，还可攻击少突胶质细胞，抑制其K+内流通道[11]，引起神经元永久性损伤[12]，通过渗透至髓鞘脂影响神经元传导的同步性[13]。体外培养试验表明，ε毒素对脑微血管内皮细胞产生快速且剂量依赖性的毒性作用[14]。显微镜下观察脑组织，可见血管周围和内部出血、水肿，白质坏死，星形胶质细胞和轴突肿胀。

作为分泌ε毒素的B型和D型产气荚膜梭菌，可对反刍动物造成严重健康威胁。B型菌主要引起羔羊痢疾，还可引起犊牛、羔羊、马驹等动物的肠毒血症。D型菌则是羊肠毒血症的主要病原，该病又称软肾病或类快疫，2月龄～12月龄的羊多发，且好发于春夏之交、秋季牧草结籽之时，羊只通过摄入被病原芽孢污染的食物或饮水而感染，对大部分羊羔而言，机体羸弱无法抵御毒素入侵而发病，对成年羊而言，暴饮暴食或食物成分突然改变，导致消化系统菌群失调，D型菌在肠道大量繁殖，毒素经肠黏膜进入循环系统，引发全身中毒。该病发病急，通常发病2 h～4 h内即可死亡，临床特征主要为腹泻、惊厥等。病理剖检可见肾泥样软化，小肠黏膜充血、出血，胸腔腹腔积液、肺充血和水肿等。组织病理学损害包括结肠炎、嗜酸性间质性肺水肿、肾小管凝固型坏死、肾间质性出血、脑血管和神经周围水肿等。

2 流行特点

全世界范围内，产气荚膜梭菌病对养殖业造成的危害不容忽视。意大利南部地区的25个羊群的羔羊产气荚膜梭菌病调查中，84%确诊为A型、16%为D型，而其中24%的分离株为cpb2毒素基因阳性[15]。在对印度北部的559头健康牛和123头腹泻新生犊牛的调查中，通过多重PCR，产气荚膜梭菌病总体发病率为37.2%[16]。在我国，产气荚膜梭菌威胁着许多动物的健康，长期以来，严重影响我国养殖业的健康发展。从报道来看，猪、牛、羊、兔是常见易感动物，在20世纪80年代末期和90年代中期我国曾有过疫情暴发。河南省疫情最早出现在1985年的周口地区，1988年以后逐渐扩散，1993年以前累计发病27个县，1994年疫情更为严重，扩散到75个县，发病牲畜7.56万头，死亡6.32万头，致死率达98.67%，到1995年山东、安徽、湖北、湖南、山西、江苏、四川、贵州等省均有疫情[17]。2011年-2015年，对河南省10个地市以及安徽、陕西等地的13个羊场进行调查，PCR检测感染率为2.35%(13/553)，主要为A型、C型和D型[18]。2014年-2015年，对广东、江西、湖北、云南四省33个猪场采集的907个粪便样本，用快速检测试剂盒进行检测，结果表明，母猪和哺乳仔猪感染严重，母猪感染率达62%～75%，仔猪感染率达80%～86%[19]。2019年，黄广明等从华北、西北和西南3个地区11个牧场的351头牛进行了粪便样本采集，结果显示，各牧场均存在较严重的产气荚膜梭菌感染，其中以犊牛和泌乳牛最为严重，重度感染率分别为49.35%和36.64%[20]。对华东部分地区羊源、水禽源产气荚膜梭菌病的流行进行调查发现，在临床934份肉羊粪样和20份组织样以及临床462份水禽粪样和87份组织样中，健康粪样的阳性检出率为19.51%，发病粪样的阳性检出率为2.38%，检测出阳性组织样均为病死样；在水禽临床462份粪样和87份组织样中，202份(43.72%)粪样和3份(3.45%)组织样检测出产气荚膜梭菌阳性。在其中68株肉羊源产气荚膜梭菌中,63.24%(43/68)的毒素基因型为A型(携带α毒素)，36.76%(25/68)为D型(携带α、ε毒素)；9株水禽源产气荚膜梭菌均为A型(9/9)。未发现B(携带α、β、ε毒素)、C(携带α、β毒素)、E(携带α、ι毒素)型[21]。

3 相关疫苗研究

3.1 传统类毒素疫苗

产气荚膜梭菌病由于发病急、病程短，往往来不及治疗动物就暴毙，所以防控该病的方法以疫苗免疫为主。目前，国内外均广泛使用产气荚膜梭菌类毒素灭活疫苗，我国本土研发生产的“羊快疫-猝狙-肠毒血症三联灭活疫苗”、“羊快疫-猝狙-羔羊痢疾-肠毒血症四联干粉灭活疫苗”、“梭菌多联干粉疫苗”等传统疫苗使用广泛。国际上也有成熟的商品化疫苗，如产气荚膜梭菌C型和D型类毒素疫苗，气肿疽梭菌-腐败梭菌-溶血梭菌-诺维梭菌-污泥梭菌-C型D型产气荚膜梭菌七联苗。一针多防，对产气荚膜梭菌病的预防起到了较好效果。由于传统疫苗依赖培养基发酵毒素，培养基又以天然动物组织为主要成分，使得批间差异较大，同时还存在抗原成分复杂、甲醛灭活耗时长、生产过程中存在生物安全隐患等缺陷。鉴于此，目前，国内外许多专家学者将目光聚焦在基因工程疫苗研发上，总体来看，为使毒素减毒脱毒，研究策略也大多以毒素基因突变、串联表达等为主，此外，多种毒素的联苗逐渐成为研究趋势。

目前,国内外产气荚膜梭菌疫苗检验标准不太一致。《中国兽药典》规定的检验方法为免疫攻毒法和血清中和法，免疫攻毒法是对免疫疫苗的家兔或本动物进行攻毒(免疫接种后14 d～21 d)，免疫组3/4保护，对照组2/2死亡即判合格。血清中和法是对家兔或本动物免疫接种14 d～21 d后采血，将血清与毒素中和后注射小鼠，根据小鼠是否死亡来测定中和效价，B型、C型和D型毒素分别至少中和1、1和3 MLD判为合格[22]。国际上效力检验通常采用产气荚膜梭菌抗毒素标准品来衡量，疫苗间隔20 d～28 d进行两次免疫，二免后14 d采血，测定动物混合血清的抗体效价，其中美国标准为β抗毒素≥10 IU/mL、ε抗毒素≥2 IU /mL，而英国标准略有不同，当其β抗毒素≥10 IU/mL、ε抗毒素≥5 IU/mL时判为合格[23]。

3.2 ε毒素减毒突变体

由于传统类毒素疫苗的制备工艺对动物组织依赖程度较大，发酵培养基原料包括牛肉、猪胃、肝脏等新鲜动物组织，生产过程复杂且批间差异大、抗原成分复杂，免疫剂量大，不仅增加生产成本还容易导致免疫动物的局部反应，为解决这一困扰，研发一种经济、有效且动物免疫副反应小的疫苗——ε毒素减毒突变体成为研究热门。与产气荚膜梭菌其他毒素相比，α和β毒素能通过免疫C端蛋白即可刺激机体产生有效免疫保护力，而ε毒素鲜有类似报道，也缺乏明确的具有免疫原性但无毒力的片段，所以通过对个别位点进行突变而获得ε毒素无毒突变体成为未来疫苗研制的方向。

为使ε毒素减毒，世界各地学者对毒素蛋白实施基因位点突变、重组等措施进行了许多尝试。通过研究发现，第29、30、36、196、199位点与细胞结合有关[24-26]，第71位点酪氨酸(71Y)被证实与毒素活性相关，缺失Y71的重组毒素在MDCK细胞上未显示毒性[27]。已证明，将106位点组氨酸突变为脯氨酸(H106P)，重组蛋白被证实无毒，免疫小鼠后，可抵抗100 LD50～ 1 000 LD50攻毒量[25,28]，但该重组蛋白可溶性表达量非常低[25]，若需要工业化生产会增加纯化的难度，从而限制了其产业化应用前景。而将H106P重组序列连于干酪乳酸杆菌，小鼠口服后能相应地产生黏膜、体液和细胞免疫应答，保护其抵抗200 LD50攻毒量[29]，相比于针剂免疫，这种口服干酪乳杆菌的方式，不仅简便易行，可减少动物应激，而且干酪乳杆菌作为一种益生菌，不仅能起到免疫调理作用，还能有效刺激黏膜免疫应答。但该方法因仅突变ε毒素蛋白的一个氨基酸，若在活载体培养或动物口服过程中发生回复突变，则可能迅速致死动物，存在较大的生物安全风险。Y196E-C(将196位点酪氨酸突变为谷氨酸后与毒素C端连接)和F199E同样是两次成功的无毒突变尝试，小鼠经过3次免疫接种后均能保护其在100 LD50毒素攻毒下存活[28,30]，而F199E毒力下降的原因是突变导致其与受体结合能力的下降[31]。为更大程度降低由单一氨基酸位点改变带来的毒力返强风险，许多研究在多位点突变上进行了许多尝试。双氨基酸突变体Y30A-Y196A显示其对MDCK细胞和小鼠的毒性降低，但对一种被改造过的CHO细胞(可表达ε毒素假定受体MAL)而言，毒性并未降低。相比而言，Y30A-Y196A-A168F减毒效果更好，不仅对MDCK细胞毒性降低3倍以上，还对上述CHO细胞毒性降低至少200倍，免疫兔和绵羊进行后，均产生了维持1年以上的高水平抗ε毒素中和抗体[32]。H106P-F199E、Y30A-H106P-Y196A以及连入Th细胞表位序列的Y30A-H106P-Y196A对MDCK细胞和小鼠(6.25 mg/kg)丧失毒力，家兔二次免疫后可产生400～4 000 小鼠MLD血清抗体效价，且攻毒试验完全保护[33-35]。

将除去N端氨基酸的ε毒素基因在大肠埃希氏菌中表达，重组蛋白分别以50、100、200 μg对兔进行二次免疫，血清抗体效价分别达10、30、40 IU/mL[36]。LTB和ε毒素线性表位(40-62)重组融合蛋白免疫小鼠后，体内和体外试验均具有ε毒素中和活性[37]。有研究人员研制的一种α、β、ε毒素基因工程三价疫苗，成功实现减毒，且分别在兔、牛、绵羊和山羊上进行间隔28 d的二次免疫，3种成分毒素的血清中和抗体效价均能达到美国和欧洲药典的规定标准，其中兔、牛、绵羊和山羊ε毒素血清中和效价分别能达到25、12.74、7.66、8.91 IU/mL[38]。产气荚膜梭菌β毒素与产气荚膜梭菌ε和腐败梭菌共表达产物混合而成的三联灭活疫苗，通过免疫家兔2次，测得血清中和效价分别为C型产气荚膜梭菌8 MLD、D型菌45 MLD、腐败梭菌1.5 MLD，且攻毒试验全部保护[39]。针对ε毒素的合成肽疫苗亦被证实有效，将肽段偶联至部分还原的破伤风类毒素(TT)，免疫接种小鼠后的血清能在体外中和致死剂量的ε毒素[40]。除了注射免疫接种，通过口服表达重组毒素的乳酸菌也能达到预期的免疫保护效果。将产气荚膜梭菌α-β2-ε在大肠埃希氏菌中串联表达而制成的基因工程亚单位多价苗，免疫接种小鼠后可产生较高水平的血清抗体，针对A、B、C和D型产气荚膜梭菌的免疫保护率分别为100%、100%、90%、100%[41]。在干酪乳杆菌中成功融合表达的α-β2-ε-β1重组毒素，α、β2、ε分别进行了单点氨基酸突变，经小鼠口服免疫3次后，能分别抵御产气荚膜梭菌强毒A型菌2 MLD和B型菌3MLD的攻毒剂量[42]。

4 结语

当前，产气荚膜梭菌病的防控形势依然严峻，而疫苗是预防该病的重要手段。鉴于传统疫苗缺陷较多，产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗成为现今的研究热点。由于ε毒素毒力强劲，在相关联苗的研制中往往成为不可或缺的组分。可喜的是，近些年的研究中诞生了许多兼具免疫原性和无毒性的优秀重组蛋白，这将是未来潜在的制苗株，这将有助于我国产气荚膜梭菌防控水平登上新台阶。