多糖自组装纳米粒子在防治犊牛腹泻中的可行性分析

金远铭 崔莲花，2 严昌国，2*

(1.延边大学农学院动物科学系，延吉 133002；2.东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，延吉 133002)

犊牛腹泻严重影响着犊牛的成活率，给养牛业带来严重的经济损失。如何治疗犊牛腹泻已成为当今世界性的难题。为了控制胃肠道感染疾病发生率，许多治疗方法都集中在使用抗生素上，然而，抗生素的不规范使用，造成抗生素耐药菌的出现，产生环境以及动物源性食品污染[1]。我国农业农村部发布194号公告，为维护我国动物源性食品安全和公共卫生安全，决定停止生产、进口、经营、使用部分药物饲料添加剂[2]。因此，寻找新的治疗犊牛腹泻的方法来替代抗生素的使用，成为犊牛疾病预防与治疗的研究重点。

益生菌(probiotics)和多糖纳米粒子(polysaccharide nanoparticles)在抑制病原菌方面都具有良好的作用效果。益生菌作为最常用的微生态制剂，其产生的抑菌物质(如乳酸和抗菌肽)和酶能够抑制病原菌的生存，调节免疫系统，并增强营养吸收[3-4]。同样，几类具有抗菌活性的多糖纳米粒子已被证明在体外模型和动物模型中治疗感染性疾病(包括抗生素耐药性疾病)的有效性[5]。研究表明，菊粉、淀粉等多糖自组装纳米粒子(polysaccharide self-assembled nanoparticles)可以内化到益生菌体内，使其释放大量的抗菌肽，并在小鼠腹泻模型中起到了益生元的作用[6-10]。由于该研究仍处于早期阶段，将其作为新型益生元应用于犊牛腹泻的治疗中需要更进一步研究与验证。本文对犊牛腹泻的原因、多糖自组装纳米粒子及其与益生菌协同作用进行了综述，分析了其在防治犊牛腹泻的实际应用中的可行性。

1 犊牛腹泻的原因

犊牛的肠道微生物菌群是一个复杂的微生物群落，在机体营养和健康方面发挥着重要作用。胃肠道健康可以定义为在不断变化的胃肠道生态系统中保持平衡的能力[11]。犊牛腹泻主要分为功能性腹泻、渗透性腹泻和细菌病毒性腹泻。功能性腹泻是由于初生犊牛脑部神经发育尚未完全，生物讯号传递体系不完整，胃肠道处于发育初期，菌群结构简单不健全引起的。渗透性腹泻是由于初生犊牛的消化机能尚未成熟，对一些渗透性的食物消化不完全，增加了肠道黏膜的渗透压，导致肠道壁的通透性增加，使得蛋白质和血液渗出而引起的。细菌病毒性腹泻是由于初生犊牛机体抵抗力较弱，受到致病菌的侵袭，定植在肠道并大量繁殖，其产生的毒素致使大肠无法吸收小肠的多余的水分，从而导致腹泻[12]。

由于集约化饲养模式，初生犊牛母子分离、代乳粉喂养、初乳摄入不足、环境应激以及使用抗生素等，这些因素改变了肠道生态系统的平衡[13]。因此，早期断奶的犊牛获得天然益生微生物的可能性大大降低，致病菌更容易定植肠道，沙门氏菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichiacoli)是初生犊牛最易感染的致病菌[14-15]。牧场存在的环境卫生问题，导致沙门氏菌等致病菌的分离频率不断增加，更有利于致病菌的扩散[16]。沙门氏菌通过入侵肠道并附着在肠黏膜淋巴结中，使机体免疫系统无法识别，导致犊牛腹泻[17]。研究人员在动物机体的巨噬细胞、扁桃体等组织内均发现了沙门氏菌，并且沙门氏菌会跟随免疫系统到达全身各处，引发疾病[18]。沙门氏菌的致病性主要与染色体上成簇分布的编码致病相关基因的特定区域——致病岛(Salmonellapathogenicity island，SPI)相关，SPI-1和SPI-5是诱发犊牛腹泻的重要因素，感染沙门氏菌的犊牛腹泻呈水样，并且具有传染性[19]。大肠杆菌根据不同的致病机理，分为6个不同的致病群，肠毒性大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)菌株是犊牛腹泻的重要的致病因素[20]。研究表明，4日龄的初生犊牛对ETEC致病菌高度敏感，其通过定植在犊牛肠绒毛上皮内，释放毒素，造成进入肠黏膜细胞的氯化钠含量上调，使得渗透压升高，导致犊牛发生腹泻[21]。

许多种类的抗菌剂被应用于犊牛腹泻治疗中。目前，大多数抗菌剂是化学修饰的抗生素类药物，这些药物可以分为杀菌(杀死致病菌)或抑菌(抑制致病菌生长)2种。随着其广泛使用和滥用，细菌对抗生素类药物产生耐药性已成为一种普遍现象。耐药性通常基于进化过程，例如长时间使用抗生素治疗，导致细菌产生可遗传的耐药性[22-23]。因此，研发出新型的防治犊牛腹泻疾病的抗生素替代品成为了重要研究课题。

2 作为活性抗菌剂的多糖自组装纳米粒子

2.1 多糖自组装纳米粒子

纳米技术为提高抗菌效率提供了新的手段[24]。尤其是纳米材料和纳米粒子，已经证明具有广谱抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌、分枝杆菌、病毒、真菌、噬菌体、原生动物和藻类的抗菌活性[25-27]。多糖是一类由多个单糖单元组成的天然聚合碳水化合物，它通过糖苷键结合在一起并形成大的聚合物，是一种纯天然可再生资源，具备无毒、无抗原性、生物相容性、生物适应性和生物可降解性[28-30]。自组装是利用疏水效应驱动分子自发进行无序到有序的转变，多糖自组装纳米粒子是在相应的溶剂中发生自组装反应形成的纳米粒子，其含有疏水性内核，同时包有亲水性外壳。亲水性嵌段和疏水性嵌段的比例决定自组装纳米粒子的形态和大小[31]。Cui等[6]和Kim等[7]研究表明，邻苯二甲酸酐的疏水基团可以结合到水溶性聚合物(菊粉)中，通过邻苯二甲酸酐的疏水相互作用形成菊粉纳米粒子。Kim等[8]通过葡聚糖中的羟基和邻苯二甲酸酸酐的羧基进行酯键反应，制成葡聚糖纳米粒子。同样，Hong等[9]研究表明，淀粉中的羟基与邻苯二甲酸酐的羧基结合后，通过透析过程中的疏水相互作用，制备了淀粉纳米粒子，并且疏水相互作用越强，纳米粒子中的邻苯二甲酸基团越多，形成的纳米粒子尺寸越小。由疏水性内核和亲水性外壳组成的纳米粒子是被广泛应用于抗菌的纳米结构类型之一，因为它们可以被哺乳动物细胞快速吸收[32]。近年来，基于多糖的生物功能性和识别作用，许多研究者已经开始合成和应用基于天然多糖自组装纳米粒子的药物传递系统[33-34]，可以说，通过多糖自组装形成的纳米粒子已经被探索用作新型抗菌剂的可能性。

2.2 多糖自组装纳米粒子与益生菌的内化效应

益生菌作为抗生素替代品的研究不断加深，益生菌通常被认为是安全无毒的，可以给宿主带来健康益处[35-36]。这些益生菌产生抗菌分子(如乳酸和抗菌肽)和酶，使它们能够抑制致病菌在肠道的定植，调节免疫系统，并增强营养物质的吸收[3-4]。因此，包括生物、物理和化学方法在内的多种方案被用来增强益生菌的生物活性，特别是通过产生具有抗菌作用的抗菌肽来增强抗菌活性[37-38]。

近年来，研究人员通过自组装的方法合成了多糖自组装纳米粒子，并将其作为新型益生元与益生菌组成合生元，在二者共培养的过程中发生了纳米粒子内化到益生菌体内的现象[6-10]。早前已有研究表明，金属纳米粒子可通过静电相互作用内化到致病菌体内，与细菌膜的离子相互作用来抑制致病菌生长[39]。然而，金属纳米粒子会在宿主体内造成严重的副作用，并能抑制机体的有益微生物生长[40]。研究人员针对多糖自组装纳米粒子这一内化现象进行了研究，Kim等[8]使用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记葡聚糖纳米粒子，观察其在不同条件下的内化现象，研究发现，纳米粒子在益生菌体内的内化程度与纳米粒子的粒径大小有关，并随着共培养时间增长和温度的升高而增加。同时，通过使用葡萄糖、半乳糖和果糖来验证多糖自组装纳米粒子的内化过程是否需要转运蛋白的参与，结果显示任何一种处理都不影响益生菌对葡聚糖纳米粒子的摄取，说明葡聚糖纳米粒子是通过被动扩散进入益生菌体内。Hong等[9-10]分别对淀粉纳米粒子和普鲁兰多糖纳米粒子进行了内化机制研究，研究发现淀粉纳米粒子根据尺寸大小、能量以及反应时间，通过葡萄糖转运蛋白内化到益生菌体内，并显著增强了益生菌对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性单核细胞增生李斯特菌的抑制作用，说明纳米粒子的内化提高了益生菌的抗菌性能，并对益生菌没有抑制作用。同时，普鲁兰多糖纳米粒子依赖能量和半乳糖转运体内化到植物乳杆菌体内。由于多糖自组装纳米粒子内化现象尚处于早期阶段，更多的内化机制还需要进一步探索。

2.3 多糖自组装纳米粒子提高抗菌肽的产量

抗菌肽在生物医学领域以及其他科学领域具有潜在的用途。益生菌分泌的抗菌肽对革兰氏阳性菌(包括致病性食物细菌如单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和一些芽孢杆菌)具有良好的抗菌活性，但是其生产工艺和成本仍然是许多研究人员关注的问题[41]。

为了增加抗菌肽的产量，以下2种方法的使用较为广泛。一种是工业发酵系统，利用全脂牛奶或脱脂奶培养益生菌用于工业生产抗菌肽。然而，这种方法在摸索最佳生产条件方面存在困难，包括酸碱度、温度、底物、通气、压力和培养期等。另一种方法是构建生产菌株，通过转基因技术产生更高产量的抗菌肽[42]。然而，人们对监管问题和消费者对转基因生物的接受程度感到担忧，尽管目前正在开发非转基因替代方法来提高本地菌株的适应能力[43]。

近年来，研究发现了一种通过益生菌生产抗菌肽的新方法[6-10]。Cui等[6]和Kim等[7]把菊粉纳米粒子作为益生元内化入乳酸片球菌体内，并将内载菊粉纳米的乳酸片球菌与致病菌共培养，相比乳酸片球菌-菊粉合生元，内载菊粉纳米粒子的乳酸片球菌具有更好的抑菌效果。通过对共培养上清液的分离纯化，验证了其分泌了大量的抗菌肽，并且远远高于乳酸片球菌-菊粉合生元的分泌量。Hong等[10]对这一现象进一步研究发现，淀粉纳米粒子在内化反应过程中导致益生菌的轻度应激，致使热休克蛋白如DnaK、DnaJ和GroES表达量显著提高，通过防御机制刺激益生菌分泌抗菌肽，使得抗菌肽的产量增加。因此，多糖自组装纳米粒子内化到益生菌体内不仅为生产抗菌肽提供了新的途径，也为开发新型的抗生素替代品提供了良好思路。

3 多糖自组装纳米粒子在治疗犊牛腹泻中的可行性

在集约化牛生产系统中，微生态制剂以其良好的抑菌特性已广泛应用于畜牧业生产中。有许多研究表明益生菌和益生元制剂对犊牛免疫力有显著改善作用。Mokhber-Dezfouli等[44]研究表明，犊牛被饲喂由乳杆菌、双歧杆菌、屎肠球菌、嗜热链球菌组成的益生菌饲料添加剂后，表现出更好的抗菌能力，腹泻发生率明显减少。Heinrichs等[45]对益生元在犊牛饲粮中的应用进行了研究，结果表明，在饲喂含有益生元饲粮的犊牛粪便中检测出了最佳的菌群结构。同样，Roodposhti等[46]研究了益生菌和益生元对犊牛生长性能、粪便中大肠杆菌和血液中免疫球蛋白含量的影响，结果表明，在牛奶中添加合生元促进了犊牛平均日增重的提高，粪便中致病性大肠杆菌数量减少了5%。目前，将多糖自组装纳米粒子内化到益生菌体内已成为一种新的、有发展潜力的抗菌肽生产方法，但是否可将其作为新型益生元应用于犊牛实际疾病预防与治疗中成为亟待解决的研究课题。

由于小鼠具有正常的肠道菌群结构，小鼠模型被用来模拟人类肠道微环境。Kim等[8]将葡聚糖纳米粒子内化入乳酸片球菌体内后，将其应用于动物模型中，研究其是否可以对动物肠道致病菌产生抗菌活性，并调节动物肠道微生物菌群结构；在使用致病菌攻毒之前，对小鼠进行为期7 d的含有或不含有葡聚糖纳米粒子的乳酸片球菌预给药，结果显示，给小鼠喂食含有葡聚糖纳米粒子的乳酸片球菌相对单独饲喂乳酸片球菌具有更明显的抑菌效果，并对小鼠肠道菌群产生了有益影响。由于致病性大肠杆菌会引发肠道炎症并破坏正常的肠道菌群结构，通过对小鼠粪便组成的分析，发现饲喂内载葡聚糖纳米粒子乳酸片球菌的操作分类单元(operational taxonomic units，OTUs)数量在所有组中是最高的，这表明使用葡聚糖纳米粒子提升了益生菌抗菌活性并且可以防止肠道微生物菌群多样性的减少。许多研究人员认为肠道微生物群多样性的丰富程度代表着肠道的健康状况[47-49]。内载葡聚糖纳米粒子乳酸片球菌抗菌活性的增强有助于降低小鼠体内的致病菌负荷。同时，试验结束后乳酸片球菌和乳酸杆菌的菌落数没有减少，并且增加了双歧杆菌的数量。基于益生元对双歧杆菌生长的影响，说明葡聚糖纳米粒子在肠道中起到益生元的作用。

通过小鼠模型的构建，证实了多糖自组装纳米粒子可以以益生元的形式与益生菌协同作用，抑制致病菌，改善小鼠肠道菌群结构，并且不会对益生菌菌群产生不良影响。如果将多糖自组装纳米粒子作为新型益生元应用于犊牛体内试验，并对预防和治疗犊牛腹泻有改善作用，将有利于犊牛的疾病防治与动物生产性能的提升。

4 小结与展望

犊牛腹泻己成为制约我国养牛业发展的主要疾病，随着集约化养殖的不断发展，给我国畜牧养殖业带来巨大的挑战。微生态制剂的应用有效避免了抗生素长期使用产生的细菌耐药性和抗药性等毒副作用。随着学科交叉融合的科研理念日益加深，多学科相互融合将带动科学发展与进步，将材料学、医药学等学科领域最前沿技术应用于畜牧学科，用最前沿的科学技术解决畜牧业亟需解决的重点与难点，是非常高效的科学方案。多糖自组装纳米粒子已经广泛应用生物学医学等领域，但在畜牧学领域应用尚属初步研究阶段，若将多糖自组装纳米粒子作为益生元与益生菌相结合，研制成新型合生元，并应用于畜牧业的实际生产实践中，解决犊牛腹泻的实际问题，将是一项可喜的研究成果。