饲料及动物源食品中重金属检测技术的研究进展

李润娴 温 洋 王凤来 贺平丽

(中国农业大学动物科技学院，动物营养学国家重点实验室，北京 100193)

民以食为天，食品安全一直是与所有人息息相关的社会热点问题。随着社会经济和工业化进程的高速发展，重金属以工业采矿、废气排放、污水灌溉和工业产品重金属超标等方式不断地排放入大气、水体和土壤中。排放的重金属不但难以被降解，还会通过被污染的大气、水源和土壤转移到植物和动物体内持续富集，从而导致各类水产和畜禽产品中多种重金属化合物含量超标，并通过食物链对人和动物的健康造成严重威胁[1-3]。例如，在日本发生的水俣病就是由于汞污染所造成的；铅广泛存在于石油、电池、电缆和管道中，对人的骨髓造血系统和神经系统有很大危害；三价铬是人体必需的微量元素，也是皮革生产中的重要物质，但是在一定条件下被氧化成六价铬就会产生强烈的毒性。为此，我国食品安全国家标准严格规定了各种食品、粮食以及饲料中重金属铅、镉、汞、砷、铬、铜、锌等的限量指标[4]。发展精准高效的重金属元素检测方法，对食品安全的监管有着重要意义。本文综述了含重金属元素样品的前处理技术和检测方法及其在饲料以及动物源食品中应用的研究进展，以期为畜牧生产中重金属地有效防控提供重要的信息支撑。

1 前处理技术

检测方法分为样品前处理和样品检测2个部分，饲料和食品等样品基质较为复杂且重金属含量较低，采用合适的前处理方法尤为重要。目前，饲料和食品中重金属测定的前处理技术主要有干灰化法、湿法消解法、微波消解法、无需消解的直接进样技术以及萃取技术[5-9]。干灰化法是将样品高温灼烧除去有机物，然后把剩余的灰分用盐酸溶液溶解后待测。这种方法操作较为简单，可处理的样品量大，但缺点是处理时间过久，在高温环境下无法准确测定一些易挥发的元素。湿法消解法则是使用强酸作为强氧化剂使样品中的有机物氧化分解，释放样品中的无机物质用于后续检测。湿法消解法的应用范围较为广泛，也可以处理大批量样品，但是由于消化过程中所用的强酸量较大，容易造成污染，并且也相对耗时。微波消解法是近年来应用较为广泛的前处理方法，它是采用硝酸处理样品，通过微波电场使分子进行高速的碰撞摩擦，在封闭容器内释放出大量气体和热量，从而使体系温度和压强升高，加快消解速度。相对于前述2种方法，微波消解法效率高、回收率高、损失小、污染小，非常适用于食品中重金属元素分析的前处理，但其缺点在于成本较高，对样品均匀性要求较高。无需消解的直接进样技术不需要进行消解步骤，通过悬浊液进样或固体直接进样，将样品直接导入仪器中进行检测。这种方法大大节省了样品前处理时间，降低了样品的损耗和有毒试剂的使用，但是也存在样品的基质干扰、受热不均、代表性差等缺点。近年来，有研究者采用萃取技术对待测物进行分离和富集，以降低基质干扰，提高检测结果的准确性。萃取技术一般是利用表面活性剂的溶解性、金属的配合能力以及一些高亲和力的吸附剂等，将目标金属从复杂样品中提取出来，达到分离和富集的目的。目前，各式各样的萃取技术如浊点萃取、液相微萃取、固相微萃取等逐渐成为重金属仪器分析技术中不可缺少的一环，极大地提高了检测的灵敏度和准确性。

2 检测技术

2.1 仪器分析

2.1.1 原子光谱法

原子光谱法主要包括原子吸收光谱法(atomic absorption spectrometry,AAS)、原子发射光谱法(atomic emission spectrometry,AES)和原子荧光光谱法(atomic fluorescence spectrometry,AFS)。

原子吸收光谱法是由待测样品中气态基态原子对光源发出的该原子的特征波长光产生共振吸收，其吸光度与蒸汽相中被测元素的基态原子浓度在一定范围内成正比，从而对试样中元素进行定量的一种分析方法。原子吸收光谱法发展时间较长，技术比较成熟，其准确性高、灵敏度高、分析速度快、应用范围广，是测定金属元素的常用方法。但此方法局限性在于不能同时做多元素分析，测定的元素种类有限，不适用于难熔元素。Silva等[7]建立了一种快速、低成本测定猫粮中总汞的光化学蒸汽发生-冷蒸汽原子吸收光谱法。他们对有机酸前体、自由基生成浓度、汞光还原浓度、样品紫外辐照时间和载气流量等条件进行了优化，在最优条件下，此方法检出限达到0.28 μg/kg，并用该方法对含有金枪鱼和其他海鲜成分的猫粮样品进行了检测。Borahan等[10]采用深共晶溶剂基液相微萃取进行富集后，通过火焰原子吸收光谱系统测定了牛奶样品中的痕量铅。此方法线性范围较宽，在50～1 000 μg/L，检出限和定量限分别达到8.7和29.0 μg/L，检测功率比常规原子吸收光谱系统提高了48倍，为牛奶样品中痕量铅的检测提供的新思路。Huang等[11]用壳聚糖/硫醇改性金属有机骨架(CS/MOF-SH)作为吸附剂，采用石墨炉原子吸收光谱仪检测，建立了固相萃取法分析痕量铅离子(Pb2+)和镉离子(Cd2+)，检出限分别为0.033和0.008 μg/L，此方法可以检测多种基质复杂的标准物质(水稻、小麦和茶叶)中痕量Pb2+和Cd2+，说明其在实际样品中监测痕量重金属离子方面有很大的潜力。Xing等[12]建立了一种快速检测谷物样品中Cd2+的新型固体采样结合电热汽化原子吸收光谱法，在最佳条件下，检出限为0.15 ng/g。此方法不进行酸消化，仪器分析时间控制在3 min以内，包括样品制备时间在内的整体分析时间控制在10 min以内。

原子发射光谱法的基本原理是待测样品中的元素经过激发后，发射特征光谱，根据该特征光谱的信息来计算待测样品中重金属的含量。该方法可以进行多种金属元素的定量测定，也可以用于未知样品中金属元素的定性识别。在电感耦合等离子体(inductively coupled plasma，ICP)作为激发光源时，可以获得较高的灵敏度和较宽的线性范围。但是原子发射光谱的谱线较为复杂，所以容易受到样品组分基质等因素的干扰。Bozorgzadeh等[13]报道了一种色散固相微萃取结合电感耦合等离子体发射光谱法测定鱼类样品中有毒重金属。该法采用了基于果胶包覆磁性氧化石墨烯的分散微固相萃取法来富集痕量Pb2+、Cd2+、汞离子(Hg2+)、钴离子(Co2+)和镍离子(Ni2+)，在鲜鱼样品中的检出限和定量限分别在0.01～0.21 μg/g和0.04～0.67 μg/g。该方法成功地实现了11种不同鱼类中有毒重金属的定量测定。

原子荧光光谱法是将待测原子蒸汽在辐射能的激发下由基态跃迁至激发态，再从激发态返回基态时辐射出的荧光，根据荧光的强度对待测元素进行定量分析。此方法灵敏度高，线性范围宽，谱线简单，能轻松地同时测定多种元素，但仅能检测具有荧光发射的元素，适用分析的元素种类有限且检测费用较高。目前，原子荧光光谱法主要用于砷和汞的测定。例如，Song等[14]合成了一种羟基磷酸铜-有机金属骨架复合物作为固相分散萃取剂，并结合原子荧光光谱成功测定了大米中的痕量汞。该方法在大米样品中的加标回收率在98.8%～109.0%，检出限为0.012 5 ng/mL。Castor等[15]建立了一种简便、廉价、快速地测定玉米和水稻样品中砷含量的方法。该方法是基于O,O-二乙基二硫代磷酸(DDTP)络合物浊点萃取富集砷，其中DDTP用聚乙二醇叔辛基苯基醚(Triton X-114)作为表面活性剂从体外萃取物生成的，然后用氢化物发生系统(HG-AFS)进行原子荧光光谱检测。该方法对水稻和玉米样品的检出限分别为1.34和1.90 μg/kg。通过对标准对照样品(米粉)进行分析，证实了该方法的准确性。试验中用该方法分析了玉米和水稻样品，均显示出较高的生物可及性砷含量(分别为72%～88%和54%～96%)，表明存在潜在的损害人类健康的风险。

2.1.2 质谱分析法

电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)是以电感耦合等离子体为离子源，在质谱仪中按照质荷比分离待测物，根据质谱结果对大多数元素(除了汞)进行定性和定量分析的方法。ICP-MS比原子光谱法更灵敏，不仅可以在短时间内同时分析多种金属元素，还可进行同位素的快速测定，与液相色谱仪等仪器联用时可进行元素形态分析，目前在重金属检测中得到了广泛的应用。但是ICP-MS易受质谱、基体效应、电离等的干扰，其设备昂贵，运行和维护成本较高。Qin等[16]设计了一种羧基功能化中空聚合物微球作为吸附剂装入固相萃取柱，然后用ICP-MS同时测定消化后的紫菜、鱼肉和鸡肉中的钒离子(V5+)、铬离子(Cr3+)、铜离子(Cu2+)、Cd2+和Pb2+。该方法在食品样品中对目标金属元素的检出限为0.20～0.80 μg/kg。Herath等[17]建立了一种超高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(UPLC-ICP-MS)同时测定不同形态砷的快速分析方法，还可以同时精确分离并定量测定亚砷酸、砷酸盐、二甲基胂酸盐和一甲基胂酸盐。此方法对不同形态砷的检出限在0.3～0.5 μg/L；该研究还定量检测了澳大利亚和斯里兰卡商用水稻中不同形态的砷，形态分析结果表明，砷离子(As3+)在水稻样品中广泛分布。UHPLC-ICP-MS能准确、可靠地鉴定和定量不同形态的砷，并且具备分离速度快、分辨率高、检出限低等优点。

2.2 快速检测技术

传统的仪器检测方法虽然可以精确测定样品中的各类重金属含量，但是对昂贵的大型仪器和专业的检测人员需求，大大提高了它们的分析成本，也成为进行大量样本实时快速检测的一大阻碍。快速检测技术建立在免疫学、纳米材料学、光谱学、电化学等交叉学科上，其检测成本低、快捷、操作简单、可进行半定量和定量分析。

2.2.1 比色法

比色法是一种基于金属离子与溶液中的物质相互作用直接引起颜色或荧光信号改变，根据溶液中颜色的深浅来测定待测物质含量的快速检测方法。此方法简单直观，分析速度快，但灵敏度低并且非常容易受到复杂基质的干扰。研究者常利用金属与螯合剂生成稳定的有色金属螯合物来进行重金属的定量测定[18]。例如，Wang等[19]建立了一种快速测定动物饲料、宠物食品和饮用水中锌的微平板比色法。用三氯乙酸提取样品中的锌离子，与2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(N-丙烷-N-磺基丙基氨)-苯酚(5-Br-PAPS)反应形成锌-PAPS配合物；筛选出由水杨醛肟、去铁胺、柠檬酸钠等成分组成的掩蔽配方，排除其他重金属的干扰；并提出一种分配校正方法，消除饲料样品产生的基质效应。整个检测过程可以在40 min内完成，线性范围在0.038～8.000 μg/mL，实际样品的分析结果与原子吸收光谱分析结果有较好的一致性。比色法的特异性比较差，在复杂基质中的抗干扰能力也较差，现有的报道中大多是应用在基质相对简单的液态样品中，在复杂固态样品中的应用比较受限[20]。

2.2.2 电化学分析法

电化学分析法是以电化学反应池中的电极发生氧化还原反应引起的电化学信号的变化为基础，根据电流、电位、电导等参数与待测物质之间的关系来进行定性和定量检测的一种分析方法。电化学分析法灵敏度高，设备简单，但是其特异性、重现性和抗干扰能力目前还有待提高，需要利用纳米材料对电极进行修饰才能实现较好的检测性能。电化学分析法在重金属离子检测中的应用主要有溶出伏安法、极谱法、离子选择电极法等。例如，王忠政等[21]建立了一种多壁碳纳米管/Nafion溶出伏安法，并成功应用于大豆和大米中重金属铅的测定。此方法线性范围为0.1～20.0 μmol/L，检测大豆和大米中铅的回收率在98.75%～101.25%，相对偏差小于5.63%，检测结果与ICP-MS的检测结果相符，可以作为粮油安全的有力监测手段。

2.2.3 免疫分析法

免疫分析法是一种使用抗体识别和捕获目标抗原或半抗原，再根据颜色、光谱等信号的变化进行定性和定量的检测方法。虽然相对于仪器检测方法免疫分析法拥有许多优势，如操作简单、特异性强、灵敏度高、适用于现场监测等，但是重金属的抗体制备难度较大，价格较高，使其发展受到了限制。在制备重金属的单克隆抗体时，一般采用重金属-螯合剂-载体蛋白质复合物作为免疫原，可以使重金属离子获得免疫原性，并防止其在动物体内与生物分子发生不可逆反应导致免疫动物中毒[22-23]。目前饲料和食品中研究较多的主要有酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫层析法(ICA)。Xu等[24]制备了Pb2+的单克隆抗体，此单抗对其他金属离子的交叉反应性小于0.943%，具有较高的特异性。基于此抗体建立了ELISA和化学发光酶免疫分析法(CLEIA)用于Pb2+的检测，检出限分别为0.7(ELISA)和0.1 ng/mL(CLEIA)，并成功应用于鸡肉、大米、牛奶等食品中Pb2+的检测。王亚楠等[25]制备了Cd2+的高特异性单克隆抗体，并用胶体金标记抗体建立了免疫层析试纸条，检出限为5 μg/L，该试纸条可以在10 min内对面粉、猪肉样品中的Cd2+进行半定量测定，非常适合食品中重金属的现场初筛。

2.2.4 生物传感器

生物传感器是一种对生物物质(包括酶、抗体、抗原、微生物、核酸等)敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。近年来，功能核酸作为分子识别元件的生物传感器在重金属检测中研究应用最广泛[26-30]，是重金属生物传感器研究的热点之一。功能核酸是一类可替代传统蛋白酶和抗体，具有独立结构，执行特定生物功能的核酸分子。其性质稳定，价格低廉，易于裁剪和修饰，包括适配体、切割核酶、错配核酶等众多类别。

适配体是通过指数富集的配体系统进化(SELEX)技术体外筛选得到单链DNA或RNA，是一种由100个以内的碱基构成的功能核酸，具有亲和力高、特异性强、易于修饰等特点，可以折叠成特定的二级或三级结构，特异性结合包括重金属在内的多种靶分子[31-32]。Khoshbin等[33]建立了一种低成本的纸基适配体传感器阵列，可同时检测汞离子(Hg2+)和银离子(Ag+)。该传感阵列是根据靶样品注入传感平台后，Hg2+和Ag+的特异性适配体的构象变化及其在氧化石墨烯表面的释放情况，通过监测荧光随离子浓度的变化进行定量检测，检出限分别低至1.33和1.01 pmol/L。该传感器可在10 min左右同时检测2种离子，并成功应用在人血清、水和牛奶的检测中。Liu等[34]设计了一种基于长链适配体功能化上转换纳米颗粒(UCNPs)和短链适配体功能化金纳米颗粒(GNPs)的荧光共振能量转移体系，开发了一种检测Hg2+的纳米传感器。在没有Hg2+的情况下，由于2个适配体通过碱基互补配对结合，导致UCNPs与GNPs之间发生荧光猝灭；在Hg2+存在的情况下，由于Hg2+与胸腺嘧啶之间的稳定结合作用，长链适配体折叠成发夹结构，导致从UCNPs释放GNPs，从而使猝灭的荧光恢复。此方法可以成功应用于牛奶中Hg2+的检测，线性范围在0.2～20 μmol/L。

金属离子依赖型切割核酶(DNAzyme)，是一类当特定金属离子作为辅助因子存在时，可以催化切割底物链使其断裂的功能核酸。切割核酶由于成本低、易于合成、性质稳定，且具有高度的离子特异性，在重金属分析领域备受关注，但是目前只有部分重金属离子有特异性切割核酶，切割核酶传感器在饲料和食品重金属检测中应用还很少[35-37]。金属离子依赖型错配核酶是另一类重金属检测领域中常用的功能核酸，错配核酶是指DNA的2个胸腺嘧啶碱或2个胞嘧啶本不可以配对，但可以分别结合Hg2+和Ag+，错配连接形成稳定的“T-Hg2+-T”和“C-Ag+-C”结构，从而进行重金属识别[38]。例如，Yuan等[39]利用T-Hg2+-T结构，通过Au@gap@AuAg纳米棒并排组装，开发了一种新型级联灵敏度的拉曼电化学生物传感器，用于Hg2+的检测，此传感器灵敏度可达到0.001 ng/mL。该研究还检测了一批饲喂高汞饲粮的鸡所产鸡蛋中的汞含量，发现蛋黄中汞的含量是蛋白中的20倍。

3 小 结

重金属的排放使环境污染日益突出，造成了食品安全问题，对人类和动物的健康造成了严重的威胁，本文综述了目前在饲料和食品领域中对重金属常用的前处理方法和分析技术。传统的原子光谱法、质谱法等仪器检测方法已经相对成熟，完成了从单一元素分析到多元素分析再到不同形态元素分析的发展，并建立了各种从样品中萃取富集痕量元素的方法，可满足不同的检测需求，但是由于大型仪器的使用，阻碍了这些方法在现场快速检测中的应用。近年来，以生物识别分子为基础的生物传感器和免疫分析法有着灵敏、快速、操作简单、适用于现场检测等独特优势，不仅成为了重金属分析领域的研究热点，也是重金属检测的未来发展趋势。目前，这些方法也存在一些问题亟待解决：样品前处理过程还需要进一步简化并减少污染；生物敏感元件成本较高，使用条件和范围还需拓宽；尚未实现不同种类不同形态的元素同步检测；检测设备还需要向微型化和便携化方向发展。核酸生物传感器已经在重金属检测领域展现出巨大优势，但是在饲料以及动物源食品中的应用还未得到拓展。免疫层析试纸条是现场初筛各类有毒有害物质以及生物标志物的有力方法，但是目前高质量重金属抗体的稳定制备和应用还处于初级阶段。随着抗体制备、适配体筛选、DNAzmye筛选、纳米材料合成、微流控系统等技术的日益发展，这些快速检测方法将会在重金属检测领域有更加实用的成果和更加广阔的应用前景。