林木基因工程的研究进展

于洋，尹琦，于爽*

(1.牡丹江师范学院，黑龙江 牡丹江 157000；2.昆明理工大学医学院，昆明 650000)

森林作为陆地生态系统的构成主体，它直接关系到在这个地球生活上的所有生物，与人类更是有着无法分割的联系，具有极大的生态重要性和经济效应。林木遗传育种在林业发展上是永恒的话题，常规育种的周期性较长是林木遗传育种的瓶颈问题。1983年，科学家首次完成了对植物的遗传改造，使加速植物育种成为可能。1986年，抗除草剂转基因杨树的问世标志着林木基因工程的诞生，迄今为止，已有几十种林木获得遗传转化[1]。

1 林木遗传转化的方法

理论上基因工程的遗传转化方法共有十多种，但在林木中实际使用最为广泛的就是农杆菌介导法和基因枪法，其次是花粉管通道法和电穿孔法。

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法是将所需的目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，再利用农杆菌侵染植株将T-DNA插入到植物基因组中，使目的基因高效表达。农杆菌介导法不仅价格低廉，而且具有基因沉默现象少、转育周期短和重复性好等优点，这使其成为现代遗传转化中实用性最强的主导方式。

Nishitani等将目的基因PDS用农杆菌介导法转化苹果，获得的转基因苹果白化表型与类胡萝卜素含量均降低[2]；伍宁丰等选取中国南方杨树N1069为受体材料，利用叶盘法将昆虫特异性神经蝎毒素AaIT基因转化至受体中，转基因杨对舞毒蛾幼虫有明显的抗性，致死率显著高于未转基因对照植株[3]；饶红宇等通过根癌农杆菌介导将Bt毒蛋白基因转入杨树NL-80106，在诸多转化株中，B45和B64对一龄舞毒蛾幼虫有明显抗性，转基因杨树叶片的幼虫致死率显著高于对照[4]。

1.2 基因枪法

基因枪法是将目的基因的遗传片段依附在高速微弹上，利用物理原理通过高速发射直接使目的基因导入受体细胞或者受体组织中。基因枪法对于目的基因的宿主选择并无限制，且由于微弹的特殊性，使目的基因的受体作用类型覆盖面相当大。乔利亚等利用基因枪法将Bt基因转入杨树，并获得了抗虫效果明显的转基因欧洲黑杨[5]；李玲等在对欧洲黑杨的研究中，使用基因枪法导入Barnase基因，最终得到了理想转基因植株[6]；崔旭东用基因枪法将多种抗寒基因和多种功能基因同时整合到欧美杨渤丰1号染色体的远端，最终培育出理想的强抗旱转基因杨树[7]。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法原理是当植株子房成功授粉后，通过在其内注入含有目的基因序列的核酸，当子房开始开花受精时，植株会出现花粉管通道，所导入的核酸就通过花粉管通道将目的基因导入受精细胞中，使外源基因被整合到受精卵基因组中得以表达，从而得到新的转基因个体。

花粉管通道法不同于其他分子层面的拼接技术，整个过程较为简便，且对实验环境要求不高，只要是开花的单子叶或双子叶林木，无论是多胚还是单胚都可以使用种质转化方式，并且可以直接将DNA重组分子导入。通过种质转化方式来进行遗传转化只能在开花植物的花期进行，而且需要大规模群体化转育。为了提高花粉管通道法在核桃中的转化率，师校欣等用“清香”核桃做材料，采用切割柱头滴加法、直接滴加法、子房注射法等方式，分别研究了外源基因导入受体所需要的时间、基因溶液的最适浓度和导入方式对效率的影响[8]。

1.4 电击法

细胞在经过瞬时间数千伏特的高压电的作用下，细胞膜发生去极化，会产生一个20～40 mm的瞬间微孔，当微孔产生时，存在在悬液中的外源核酸从细胞膜上的微孔进入，与细胞内的受体细胞基因整合的过程叫做电击法。电击法操作简便，且作用效果直接高效，自从选用磁性纳米颗粒作为外源基因的DNA载体后，其转化效率也变得更高。

McCown 等利用电击法将外源基因与Bt基因融合并导入杂种杨中，使转基因植株产生了对鳞翅目昆虫的抗性[9]；Liu等利用电击法将Bt基因导入华山松中，证明了当电击的受体为成熟的体细胞胚时，更加有利于外源基因的整合[10]。

2 林木基因工程的应用

2.1 植物修复

工业的迅速发展不仅对土壤和水资源带来了难以恢复的损伤，遗留的污染物更是给如今的人们留下了大大的难题，并且还存在化学杀虫剂残留所导致的极端土质等问题。上世纪八十年代起运用植物处理污染物的设想首次被提出，污染物治理的方法便开始由物理化学手段向植物修复手段进行转移，这也为林木应用提供了一个育种方向。

柴文娴获得的转MT基因的南林895杨树既可以给具有挥发性的化学农药所释放的碳氢化合物解毒，还能够吸收土质中的重金属元素[11]，是目前退耕还林和矿区种植的首选树种类型。Rugh 等获得的改良汞还原酶(MerA)基因的转基因黄杨可以使高毒的离子汞Hg(II)转化为毒性低毒的元素汞Hg(O)[12]。

2.2 抗病虫害应用

在林木漫长的生长期过程中病虫害会导致林木生长受到抑制，降低林木存活率，从而造成森林面积的减少。现今由于人工林的树种单一，且由无抗性纯林组成，使其更容易被病虫侵害。随着林木基因工程的发展，林木抗病虫害育种方面已有相当广泛和突出的应用。

黄艳等将球孢白僵菌中的几丁质酶基因转入毛白杨中获得了抗病转基因株系[13]。自饶红宇等获得抗虫欧洲黑杨后，又相继有抗舞毒蛾和天幕毛虫的转基因杂种杨[14]、抗食叶昆虫的转基因杨[15]和抗鞘翅目昆虫的741杨等问世[16]。

2.3 抗逆改质

通过转基因技术拓宽林木生境、拯救极端环境的植物缺乏和改良林木品质，一直是国内外林木育种研究中的热点，现已有诸多报道。

在抗逆方面，继我国育成首例大田生产的抗盐碱转基因杨树—中天杨[17-18]后，杨春霞、姜超强等也相继获得了抗旱耐盐的转基因杨树[19-20]；Arisi等获得了抗冻性显著提升的转基因杨[21]。

在品质改良领域，白爽将柽柳lea基因导入小黑杨，结果显示转基因杨光合效率更高[22]，姜超强将AtNHX1基因转入欧美107杨中，也获得了光合作用效率更高的转基因植株[23]；张国壁通过转AlaAT(丙氨酸氨基转移酶)基因提高了小黑杨固氮效率[24]；Hu等将辅酶A连接酶(4cl)基因转入美洲山杨，转基因杨木质素下降了45%，且纤维素增加了15%[25]；Weigel 等将拟南芥Leafy基因转入杨树中得到转基因杨，结果表明转基因杨的花期明显提前[26]；何业华等将番茄ACC合成酶反义基因导入不同的枣类品种，最终获得耐储存转基因枣类品种[27]。

3 林木基因工程展望

森林作为生态环境和经济发展的重要一环，所能创造的生态效益和经济价值是非常巨大的。总体看来，林木基因工程具有非常广阔的发展空间，当前林木基因工程正处于前人开疆，后人扩土的绝佳发展层面，要保持充分的投入，才会保证发展的可持续性。

转基因技术应用于林木遗传改良已有几十年的历史，但还存在一些技术问题有待解决，如常用转化手段的转化效率问题、个别树种转基因体系建立的问题等。此外，转基因物种的安全性问题也不容回避，甚至关乎林木基因工程的未来发展和可行性。