帕金森病实验动物模型的研究进展及评价

蒙健林,梁健芬,张兴博,文铭钧,邓仙勇

(1.广西中医药大学,南宁 530023;2.广西中医药大学第一附属医院,南宁 530023)

帕金森病(Parkinson disease,PD)又称为震颤麻痹(paralysis agitans),是一种世界范围内普遍存在的神经系统退行性疾病,影响到3.7%的65岁以上人口[1]。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征[2]。PD的病因尚不清楚,尽管研究表明其病因涉及多因素,如遗传、环境和衰老等[3]。帕金森病的主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元变性丢失,因此,帕金森动物模型制备的主要思路是利用化学、物理等方法来破坏黑质-纹状体多巴胺递质神经系统,使其神经元变性丢失,从而产生帕金森病特异性的病理改变[4]。目前常用的帕金森病动物模型主要包括:(1)化学损毁因素制备的帕金森病动物模型,如1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)、6-羟 基 多 巴 胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、鱼藤酮(totenone)、百枯草(paraquat,PQ)等制备的模型;(2)机械、物理损毁因素制备的帕金森病动物模型;(3)基因工程技术制备的动物模型[5]。这些模型能够在一定程度上再现包括运动缺陷、黑质致密部多巴胺能神经元进行性丢失和路易体形成等在内的帕金森病主要生理、病理特征[6]。可用于建立PD模型的动物种类繁多,每种动物都有不同的优点和局限性。此外,基于细胞的模型也成为PD研究的模型。本文总结了近年来PD实验模型的研究进展并对其做出评价。

1 化学损毁因素制备的帕金森病动物模型

1.1 1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)模型

研究表明MPTP是合成海洛因的毒性成分之一,此前有报道称加利福尼亚的一些海洛因吸食者出现高度相似于帕金森病的症状[7]。MPTP已被用于诱导无脊椎动物和脊椎动物多巴胺能变性,后者包括非人类灵长类动物、小型猪、大鼠等[8]。MPTP是一种亲脂性化合物,可以穿越血-脑屏障(bloodbrain barrier,BBB),一旦进入大脑,会被单胺氧化酶B(monoamine oxidase B,MAO-B)代谢为强效的多巴胺能神经毒素MPP+,多巴胺转运体主动将MPP+摄取到多巴胺能神经元的线粒体内,使线粒体复合物的活性受到抑制,从而导致多巴胺能神经元变性、死亡[9]。例如,MPTP通过靶向线粒体来诱导PD样病理,因此,它是研究线粒体功能障碍的有用模型[10]。MPTP病变模型总体上具有显著的运用价值,其优点在于它对黑质致密部和纹状体均有较强的敏感性,可以应用于PD发病过程中线粒体复合物活性受到抑制等相关方面的研究;并且MPTP诱导的PD动物模型能够较为准确地模拟出PD病人的运动障碍症状[11]。然而,MPTP方法并没有完全复制动物的PD病理[12]。MPTP动物模型不能复制PD的多系统病理,也不能形成细胞内的蛋白质聚集体[13],也很难观察到路易小体的产生[14]。用药量和方法不同均对MPTP模型的造模结果有较大影响[15],在小鼠中可能导致高死亡率、行为和生化结果的可变性、以及小鼠自身能过对MPTP造成的病理损害进行一定的自发修复[16-17]。

1.1.1 MPTP猴模型

在医学研究中,非人类灵长动物(non-human primates,NHP)在提供对疾病机制的重要见解方面发挥了关键作用,因为NHP与人类的遗传和生理密切相关[18]。通常多用猕猴、食蟹猴等,在血管造影下注入MPTP的介入法和分离颈动脉分叉部,夹闭颈外动脉,穿刺颈总动脉注药的手术方法,均可制作满意的猴偏侧PD模型[19]。此外,MPTP损伤的猴子在基于电路调制的新的对症治疗方法中起着至关重要的作用[20]。NHP帕金森病症状可通过给药神经毒素或携带异常基因的病毒载体产生。表型的严重程度可以通过一个统一的帕金森病评定量表(UPDRS)来测量,但是对NHP的评估还没有标准化[21]。NHP模型表现出像人类一样的症状,例如猕猴表现出左旋多巴引起的运动障碍,类似于人类的舞蹈肌张力障碍。可以通过塔式跳跃实验和沙漏实验评估NHP的运动障碍和轴向刚度。此外,与啮齿动物相比,猕猴更好地复制人类的睡眠模式,这使得它成为研究睡眠或社会行为相关症状的优越模型[22]。然而,由于NHP的研究需要大量的劳动力和费用以及面临伦理考验,故一般仅用于临床前评估治疗[23]。

1.1.2 MPTP小鼠模型

与灵长类动物相比,啮齿类动物具有价格便宜、易于控制等特点,小鼠模型适合于研究MPTP的毒性机制及神经保护性药物的研发,目前MPTP小鼠模型已经被广泛用于帕金森病的实验治疗。根据研究目的不同,MPTP小鼠模型的制备方式分为4种:(1)症状前帕金森病模型:小剂量MPTP(10～20 mg/kg),一次腹腔注射,适合研究代偿机制;(2)急性帕金森病模型,20 mg/kg的MPTP间断腹腔注射4次,每间隔2 h,导致细胞快速坏死;(3)亚急性帕金森模型,20～30 mg/kg的MPTP注射,1次/天,连续5 d,导致缓慢的细胞凋亡;(4)慢性帕金森病模型,MPTP剂量为4 mg/kg,1次/天,连续20 d。MPTP损伤的模型小鼠在急性中毒期表现出瞳孔散大、竖毛、唾液过多及阵挛性的癫痫发作等症状,一般出现在注射后的15～30 min内,但可很快恢复正常[24]。有的实验则观察不到这些行为改变,这可能与小鼠种属、年龄、药量等MPTP敏感性的不同相关。因而尽管模型小鼠有自主活动减少的症状,但很少能见到长时间典型的帕金森病运动障碍。

1.2 6-羟多巴(6-OHDA)模型

6-OHDA是一种儿茶酚胺选择性神经毒素,能够通过多巴胺或去甲肾上腺素转运体进入神经元。6-OHDA模型在PD研究中得到了广泛的应用,其诱导的实验动物具有一致的行为表型并且6-OHDA模型能够预测多巴胺能神经元的变性[25]。6-OHDA模型的优点在于其能过选择性捣毁黑质多巴胺能神经元,不会影响其它的神经元,因此可有效用于研究治疗PD药物疗效。其缺点在于6-OHDA诱导的帕金森病动物模型最主要的运动障碍表现是偏侧旋转,不能很好地模拟出PD常见的临床症状如静止性震颤、运动功能减弱、肌肉僵直及四肢拘挛等。6-OHDA模型是造模时间短的急性损伤模型,不能表现人类帕金森病病情进展缓慢、病程长的特点。该模型也不能表现出帕金森病的一大基本病理特征:路易小体(Lewy bodies)的聚集[26]。利用6-OHDA构建PD模型最常见的三种注射靶点是黑质、内侧前脑束(MFB)和纹状体。在MFB中注射6-OHDA是获得显著可再生的多巴胺能变性模型的首选方法,即使在很长的生存时间内,动物也几乎没有自发补偿的倾向[17]。该模型具有DA病变的可预测性、稳定性且病变程度严重,因此对于评估长期药理治疗或神经转运作用的研究特别有用。但是6-OHDA病变不模拟PD的多系统病理[27]。黎民等[28]选取不同部位注射不同剂量6-OHDA建立帕金森病大鼠模型,进行对比分析后发现位于中脑黑质致密区单点注射24 mg建立PD大鼠模型,操作过程相对简便,造模成功率高,模型病理特征稳定,且动物死亡率低,是一种可以广泛应用的PD大鼠模型建立方法。

1.2.1 双侧6-OHDA损毁模型

造模方法为采用200～300 g大鼠在麻醉后进行大脑立体定位,将6-OHDA注入双侧黑质或前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)。由于双侧注入6-OHDA不仅可以引发动物出现运动障碍症状,还会出现较为严重的吞咽障碍、渴感缺乏等症状,动物因不能进食和饮水而出现死亡率极高的现象,相对较少采用。

1.2.2 单侧6-OHDA损毁模型

动物及手术操作同双侧模型。根据注射药物剂量和注射位点的不同,采用立体定位将一定量的6-OHDA注射至一侧的黑质或内侧前脑束可以建立所谓“单侧”损伤的帕金森病模型,一般在注射后24 h出现多巴胺神经元的变性,2～3 d后出现纹状体内多巴胺含量减少,成功的模型发现其纹状体内多巴胺含量减少了80%～90%[29]。6-OHDA单侧损毁的模型是目前在研究中使用最多的动物模型之一,它可以表现出类似于人类帕金森病的病理特点,如黑质多巴胺能神经元的变性坏死、胶质细胞增生、纹状体多巴胺含量降低等,可以在同1只动物的损伤侧与非损伤侧进行相互对比;另外,最突出的优点就是药物诱发的旋转行为检测,是评价帕金森病干预疗效的一个稳定可靠的指标。梅加明等[30]实验研究发现三靶点注射6-OHDA至纹状体不仅能稳定高效制备慢性PD动物模型,同时也降低了大鼠死亡率,是一种有效的PD制备模型。

1.3 鱼藤酮模型

鱼藤酮是一种天然化合物,常被用作杀虫剂。它具有亲脂性,能穿透血脑屏障,作用于非多巴胺神经元,释放细胞因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)物质,引起多巴胺神经元凋亡或坏死;或者直接作用于多巴胺神经元内的线粒体,释放ROS,干扰多巴胺代谢,最终通过氧化应激和能量障碍,导致细胞凋亡或坏死,从而使生物体出现PD样症状[31]。研究者曾将极高浓度鱼藤酮通过立体定向注入神经元细胞,导致纹状体多巴胺和5-羟色胺显著减少[32],然而高剂量鱼藤酮对多巴胺能神经元没有特异性。事实上,高浓度的鱼藤酮在纹状体区域引起了液化坏死。相反,当长期吸入较低剂量鱼藤酮时,它能够在黑纹质区选择性地诱导细胞变性[33]。

原发性帕金森病的一个重要特征是黑质区路易小体的富集,路易小体的主要组成部分是纤维状的α-突触核蛋白(α-synuclein),而在正常情况下,α-突触核蛋白为细胞中非纤维化的可溶性蛋白质,因此α-突触核蛋白的纤维化在帕金森病的发病中起重要作用[15]。研究表明,对大鼠慢性注射低剂量鱼藤酮,会引起黑质区多巴胺神经元的退化,而存活下来的黑质神经元细胞质中也出现了与路易小体极为相似的富含α-突触核蛋白的包涵物[33]。此外,在鱼藤酮动物模型中观察到其他PD相关特征,如运动缺陷、儿茶酚胺耗竭和黑质多巴胺细胞丢失。它具有复制人类PD关键病理特征的能力,可以成为进行神经保护研究的有价值的工具。该模型已被用于研究褪黑素在神经保护中的作用[34]。因此,与MPTP模型相比,鱼藤酮模型是研究PD病理中路易小体形成的理想模型。但是鱼藤酮存在半衰期短、降解快的特点。随着时间的推移,鱼藤酮模型自愈性越来越明显,因此不能很好地模拟出人类PD的慢性进程。

1.4 百草枯模型

百草枯(paraquat,PQ)是发展中国家农业劳动者普遍使用的一种除草剂[35]。其与MPP的结构具有相似性,被认为是一种神经毒物[36],它可能是PD病因的环境因素之一。百草枯在体外和体内均能诱导星形胶质细胞衰老和激活细胞衰老相关分泌表型,衰老细胞的耗竭对PQ诱导的神经病理有保护作用。Chinta等[37]的研究数据表明,接触某些环境毒素会促进大脑中衰老细胞的积累,这可能导致多巴胺能神经元变性。全身注射百草枯会导致多巴胺能神经元丢失。百草枯会损害谷胱甘肽和硫氧还蛋白的氧化还原循环,影响保护细胞免受氧化应激的功能[38]。然而,一项研究表明,长期服用百草枯会导致慢性神经变性和多巴胺耗竭,可用于研究PD的临床前阶段[39]。PQ也会导致线粒体功能受损,这与人成纤维细胞的衰老诱导有关[40]。

但是,百草枯模型也存在缺陷。国内外通常采用通过腹腔、脑内或皮下注射百草枯的方法建立小鼠、大鼠PD模型,且每次给药剂量大,用药时间短。这样的造模方式与人类的主要经口暴露于百草枯的方式不一致。罗烘权等[41]通过口服途径使大鼠较长时间暴露于百草枯,模拟人类接触百草枯的方式建立PD大鼠模型,该方法也具有造模所需时间较长,不具备时效性的弊端。

2 机械、物理损毁因素制备的帕金森病动物模型

MFB是大鼠黑质多巴胺能神经元传递到纹状体的主要通路,同时,该通路也是纹状体源性神经营养因子营养黑质致密部多巴胺能神经元的途径。因此,MFB受损后会造成黑质致密部多巴胺能神经元缺乏营养因子而死亡。Brecknell等[42]于1995年利用线刀切断MFB造成大鼠中脑多巴胺能神经元死亡建立了机械损伤的PD模型。这种方法定位准确,对其他脑区损伤小,且成功率高,实验成本低。同时能够造成多巴胺神经元渐进性地损伤,可以模拟PD病理变化的全过程。因此,该方法被较多研究者使用,尤其是在研究如何预防PD以及神经元再生等领域。但是建立该模型观察的时间周期太长,且手术后不易把握损伤的程度。由于神经毒素6-OHDA等模型的急性严重损伤特性难以表现出帕金森病病情的渐进性发展趋势。因此,建立一种能较好地模拟SNc部位多巴胺能神经元进行性变性坏死的动物模型极为重要。在MFB损伤第18天和第19天后分别造成44%和50%多巴胺能神经元死亡[43]。这种机械损伤后仍有一定数量神经元存活,为研究受损黑质多巴胺能神经元的再生能力提供了一种良好的动物模型。

2000年,梁希彬等[44]在国内首次尝试了线刀机械损伤模型,并将其应用到电针治疗帕金森实验中。结果显示,MFB损伤1周后开始出现APO诱导的异常旋转行为,且随周龄增加其症状加重,甚至在造模第10周这一现象仍然存在。这一行为可能与多巴胺神经元的丢失相关。MFP切断4周后,黑质60%的多巴胺神经元发生进行性死亡,纹状体内多巴胺含量下降了40%～60%。同时,在这种模型上可以检测到其纹状体内神经递质的失衡。由此可见,采用可伸缩式线刀(retractable wire knife)切断MFB,造成大鼠中脑多巴胺能神经元变性死亡方法也被广泛使用。这种方法既定位准确,又能造成多巴胺能神经元渐进性的损伤。

3 基因工程制备的动物模型

遗传因素在家族性帕金森病的发病中起着决定作用,目前已经发现多个具有家族遗传性的帕金森 病 致 病 基 因,如 α-synuclein、Parkin、LRRK2、PINK1及DJ-1基因等[45]。通过α-突触核蛋白和LRKK2的转基因过表达或对Parkin、DJ-1和PINK1等基因的敲除建立PD的遗传模型,可研究这些基因在PD病理中的分子机制[46]。目前较多使用的转基因动物模型是表达人α-synuclein的微包涵体,部分动物出现一定程度的运动障碍[47-48]。在新近的研究中,有研究采用在星型胶质细胞中过表达A53Tα-synuclein的转基因小鼠,发现在此模型的中脑、脑干、脊髓中均出现了广泛的炎症反应,并伴有中脑多巴胺能神经元的坏死和瘫痪等运动障碍,然而这些模型很少重现疾病的完整特征,而且往往与人类的情况有很大的不同,大多数遗传模型未能诱导多巴胺能神经元的显著丢失[49]。Nagoshi[50]用果蝇构建的α-synuclein转基因PD模型具有DA神经元丢失、路易小体形成、运动功能退化等与人类相似的病理特征,且用果蝇建立PD模型,其繁殖速度快、遗传规律简单、经济成本低。

4 讨论

帕金森病已成为既阿尔兹海默症之后第二大危害老年人的疾病,但目前人类对其发病机制的认识尚未明确,尚无有效的治疗手段。人类想要认清PD发病的机制,完全治疗PD,首先要构建出能完全与人类PD发病机制一样的动物模型。但目前为止仍然缺乏一个能完全模拟临床PD病理改变、发病症状以及病程变化的理想动物模型。目前帕金森病实验动物模型的种类繁多,表现出的帕金森病症状程度及病理改变各不相同,各种动物模型都有各自的优点与不足,因此可根据实验目的不同选择相应的模型。随着帕金森病发病机制的研究逐渐深入,相信帕金森病动物实验模型的建立将会日益完善。