改良小培养技术在黄柄曲霉形态学观察中的应用

冯长海

（上海皓信生物科技有限公司，上海 201109）

曲霉属是临床常见的一类条件致病性真菌，可根据其形态、生理和系统发育特征进行鉴定与分类，形态学由真菌的菌落特征及其镜下结构特征组成，其中分生孢子头的形状，小梗单层还是双层，梗茎、顶囊、小梗及孢子的颜色、大小、形状、质地，是否存在壳细胞、闭囊壳、子囊和子囊孢子是曲霉的重要镜下结构特征，也是鉴定曲霉的重要依据。黄柄曲霉是少数可产粉孢子的曲霉[1-2]，可导致免疫功能不全儿童感染引发皮肤曲霉病，还可引起骨髓炎、耳真菌病、甲真菌病和椎间盘炎等[2-3]。本研究采用自制玻片进行黄柄曲霉的小培养试验，探讨改良小培养技术在黄柄曲霉微观形态学观察中的价值。

1 材料和方法

1.1 材料

乳酸酚棉兰、PDA培养基（英国Oxoid公司），离心管（50 mL规格）、无菌水、小培养玻片和一次性无菌加样枪头（上海皓信生物科技有限公司），实验用黄柄曲霉（上海市公共卫生临床中心赠送），黄柄曲霉标准菌株KP281443株序列相似度100%（北京睿博兴科生物技术有限公司测序）。

1.2 方法

将实验用黄柄曲霉菌株接种在PDA培养基上，室温培养，待菌株成熟后备用。将小培养玻片凹面朝上，放置于生物安全柜内台面上，紫外线照射30 min后备用。用加样枪吸取已融化的PDA培养基25 μL注入在玻片中央凹槽，待琼脂凝固后，在中央凹槽红点处接种黄柄曲霉，盖上盖玻片，在盖玻片蓝点处用固封剂固定盖玻片。将接种了菌株的玻片平放于内含1滴蒸馏水的50 mL离心管中，25 ℃条件下培养。每日镜检观察黄柄曲霉的形态生长变化，待菌株生长成熟（曲霉特征结构大量出现）后，用乳酸酚棉兰染液沿玻片与盖玻片间缝隙缓慢加入，显微镜观察、拍照。见图1。

图1 改良小培养技术操作示意图

2 结果

黄柄曲霉25 ℃培养4 d后观察可见：菌丝透明、有隔；分生孢子头呈松散放射状或放射状；顶囊匙形或梨形，基部收缩；小梗单层或双层，覆盖顶囊1/2至1/3；分生孢子球形或近球形，壁光滑；分生孢子梗透明至浅棕色，梗壁光滑、无隔或偶见有隔；粉孢子球形或近球形、偶见椭圆形或倒棒状，无柄或1～4个着生于孢子梗上；可见不完全产孢结构。见图2。

图2 黄柄曲霉25 ℃培养4 d镜下图（ ×1000）

3 讨论

小培养法是Emile Rivalier和S.Seydel于1932年报道的一种研究丝状真菌生命活动的培养方法，可有效地观察丝状真菌的产孢过程。通过真菌孢子、产孢结构及菌丝的形态特征，三者相互间的位置排列关系，结合丝状真菌常规培养的特征，或结合真菌的生理生化特征，可进行丝状真菌的形态学鉴定。传统小培养方法或小培养改良方法多是将真菌培养基置于观察载体平面（载玻片或类似物）上，接种真菌后覆盖盖玻片或类似物，送入孵箱进行培养[4-7]。采用此类方法时，如果直接镜检，因盖玻片和载玻片间距离较大，就会出现菌体重叠，不易获得较好的真菌图片；如果揭离盖玻片后制片镜检，因在揭片过程中真菌孢子的自然生长状态遭到人为破坏，会导致菌体结构不完整，背景杂乱，成像效果不佳。即使技术娴熟的操作人员，要获得清晰、典型、完整的真菌图片，往往也需要大量制片。本法是在观察载体平面（载玻片）内部进行真菌培养，较易获得清晰、典型、完整的真菌图片。

《美国临床微生物手册（第11版）》[8]提供了16个临床相关曲霉种的重要形态结构特征图解，可作为临床相关曲霉种的形态学鉴定方法，该手册将黄柄曲霉归类为双层小梗的曲霉，通过松散柱状的分生孢子头、白色至浅棕色的分生孢子和棕黄色至黄色至无色的分生孢子梗的表型特征，可快速鉴定黄柄曲霉。但黄柄曲霉并非只有双层小梗，还有单层小梗，应属单层和双层小梗均有的曲霉分类。当黄柄曲霉单层和双层小梗均出现时，采用该手册提供的方法就会无法进行鉴定。黄柄曲霉是除土曲霉外少数具有粉孢子的曲霉[1-2]，利用此特性，结合其分生孢子梗颜色等其他镜下或菌落特征，可进行黄柄曲霉的辅助鉴定。同样，黄柄曲霉不完全产孢现象和单层小梗的发现，深化了黄柄曲霉的形态学认识，表明改良小培养技术在黄柄曲霉形态学鉴定中具有较好的应用价值。

综上所述，黄柄曲霉的镜下结构特征是其形态学鉴定的重要依据，改良小培养方法可清晰地观察到黄柄曲霉的结构特征，是较好的一种真菌形态学研究技术。