大鼠颅骨材料力学和骨质参数的增龄性变化

2021-03-30李曼李明杰黄江乐翠云王尧赵令强王承飞万昌武汪家文

法医学杂志 2021年1期

李曼，李明杰，2，黄江，乐翠云，王尧，赵令强，王承飞，万昌武，汪家文

1.贵州医科大学法医学院，贵州贵阳550004；2.广西医科大学第一附属医院，广西南宁530021

颅骨是由23 块形状、大小均不同的扁骨和不规则骨组成的特殊球形体，位于脊柱上方，起着支撑和保护脑组织的作用[1]。位于颅骨上表面的额、颞、顶、枕骨主要由外板、板障和内板3 层结构组成，类似“三明治”结构，颅骨的生物力学性状即由其3 层结构以及骨密度、骨厚度等多种因素共同决定。研究[2-4]结果表明，颅骨的生物力学性状和微观结构具有与年龄相关的重要特征，不同年龄颅骨影像学参数和材料参数存在差异[5-6]，但现有研究覆盖的年龄范围较窄[7-8]，且不同年龄之间颅骨骨折阈值差异方面的文献也较少[7，9-12]。本研究以SD 大鼠为研究对象，探讨其颅骨材料力学及骨质参数的增龄性变化规律，为颅骨骨折的生物力学响应、头颅有限元模型建模及年龄推断提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性SD 大鼠48 只，由贵州医科大学实验动物中心提供［合格证号SCXK（黔）2018-0001］，按出生年龄分为2、4、6、8、17、26、52 和104 周龄组，每组6 只。本研究经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准（审批号1901050），实验严格按照动物伦理要求进行。

1.2 方法

1.2.1 样本预处理

各组大鼠按0.5～1.0 mL/100 g 剂量腹腔注射10%水合氯醛溶液，过量麻醉致死[13]后分离头部，使用牙托粉制成模具固定头颅，去除颅顶部软组织暴露颅盖骨，使用生理盐水浸湿的纱布覆盖于颅骨表面保湿。

1.2.2 颅骨材料力学参数检测

所有样本于2 h 内行颅骨压缩试验，检测材料压缩参数。将固定好大鼠头颅的牙托粉模具置于KD Ⅱ-0.2 型微机控制电子万能试验机（深圳市凯强利试验仪器有限公司）承重底座上，使用直径3.0 mm 圆柱形压具，调节压具接触面高度至刚好接触大鼠右侧颅顶骨中部。预调3 次达到稳定状态后在室温下进行压缩试验（图1）。加载参数设置：试验速度为5 mm/min，预加载力为0.5 N，停机条件为位移5.0 mm（预实验证实未接触颅底，但颅顶骨已发生骨折），材料试验机自带软件KPTest V4.3ch（深圳市凯强利试验仪器有限公司）自动输出极限载荷、压缩强度、压缩模量。

1.2.3 颅骨骨质参数检测

压缩试验完成后，咬骨钳分离顶部颅骨片，采用ZKKS-CT 小动物Micro-CT 系统（广州中科恺盛医疗科技有限公司）扫描颅骨样本。扫描参数设置：射线管电流159 μA，电压70 kV，扫描物长度30 mm，扫描分辨率30 μm，曝光时间600 ms，扫描角度180 度。正式扫描前使用体膜进行标定，得到原始图像。将原始图像导入三维医学图像处理及分析系统（3D medical image processing and analyzing system，3DMed；中国科学院自动化研究所医学图像处理研究室开发），将图像调整至矢状位，对颅骨顶部中段全层进行3 次厚度测量，取平均值为各颅骨的厚度值，并通过肉眼观察各组图像，对比分析其颅缝闭合情况及骨折类型。取颅骨中段3 mm 厚度（切片间距0.03 mm，100 片）为感兴趣区域（region of interesting，ROI），设定灰度阈值后，Micro-CT 系统控制插件（中国科学院自动化研究所）直接测量并计算出骨密度、骨体积、骨小梁厚度、颅骨厚度等骨质参数。

图1 大鼠颅骨单向纵轴压缩试验示意图Fig. 1 Schematic diagram of unidirectional longitudinal compression test of rat skulls

1.2.4 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件（美国IBM 公司）进行统计学分析，数据均以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法。采用Pearson 相关性分析对极限载荷、压缩强度和压缩模量与年龄之间的相关性（相关系数r）进行分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠颅骨材料力学参数增龄性变化

各组大鼠颅骨极限载荷、压缩强度和压缩模量组间差异均具有统计学意义（P＜0.05，表1）。进一步两两比较显示：17 周组极限载荷及压缩强度与6 周组、8 周组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；26 周组极限载荷、压缩强度与8 周组、17 周组比较，差异均具有统计学意义，压缩模量仅与17 周组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；52 周组极限载荷、压缩强度与17 周组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。统计分析表明，极限载荷、压缩强度和压缩模量在26 周前均呈增大趋势，与年龄呈明显正相关（r值分别为0.937、0.937、0.818，P＜0.05）。极限载荷、压缩强度、压缩模量均在52 周组时降低，但在104 周时又上升［与26 周组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）］。

表1 各年龄组大鼠颅骨材料力学参数增龄性变化Tab. 1 The age-related changes of material mechanics parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

注：1）与6周组比较，P＜0.05；2）与8周组比较，P＜0.05；3）与17周组比较，P＜0.05。

压缩模量/MPa 9.68±1.64 16.91±3.93 55.14±19.10 80.61±31.39 127.93±26.70 210.13±113.482）168.97±102.27 245.23±109.42组别/周2468 17 26 52 104极限载荷/N 5.62±1.33 11.05±2.41 22.91±6.85 28.30±9.19 44.91±11.921）2）68.41±7.712）3）61.01±22.573）65.08±25.35压缩强度/MPa 0.80±0.19 1.56±0.34 3.24±0.97 4.00±1.30 6.35±1.691）2）9.68±1.092）3）8.63±3.193）9.21±3.59

2.2 大鼠颅骨骨质参数增龄性变化

各组大鼠颅骨骨密度、骨体积、骨小梁厚度和颅骨厚度总体组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）。各年龄组两两比较上述骨质参数结果见表2：随年龄增长，骨密度、骨体积和骨小梁厚度在2～52 周组均随年龄呈增大趋势（骨小梁厚度26 周组稍降低），与年龄呈正相关（r值分别为0.965、0.963、0.913，P＜0.05）；52 周后稍降低。

大鼠颅骨的冠状缝、矢状缝和人字缝均随着年龄的增长表现为宽→窄→融合变化趋势，骨折类型也存在差异。2 周组未见明显骨折线，但受压缩侧与对侧相比可见明显骨缝分离。4～104 周组均可见明显凹陷性骨折痕迹，且随着年龄增长，凹陷程度逐渐加重，直至出现孔状骨折。大鼠颅骨的矢状位扫描图显示，随着大鼠年龄的增长，颅骨厚度逐渐增大。骨折形态方面，2～4周组仅见颅缝分离，6～104周组则出现粉碎性骨折，骨折形态呈“口小底大”的“火山口”样外观（图2～3）。

表2 各年龄组大鼠颅骨骨质参数增龄性变化Tab. 2 The age-related changes of bone material parameters of rat skulls at different age groups（n=6，）

注：1）与2 周组比较，P＜0.05；2）与4 周组比较，P＜0.05；3）与6 周组比较，P＜0.05；4）与8 周组比较，P＜0.05；5）与17 周组比较，P＜0.05；6）与26周组比较，P＜0.05；7）与52周组比较，P＜0.05。

组别/周2468 17 26 52 104骨密度/（mg·mm-3）103.15±1.96 155.60±3.271）233.99±7.891）2）279.41±15.412）3）290.61±18.483）365.91±15.534）5）600.62±26.395）6）469.58±23.646）7）骨体积/mm3 1.30±0.47 2.59±0.181）4.09±0.341）2）4.54±0.322）5.73±0.383）4）7.63±0.364）5）11.20±0.665）6）10.36±0.496）7）骨小梁厚度/mm 0.11±0.02 0.19±0.031）0.22±0.021）0.28±0.022）3）0.36±0.033）4）0.33±0.034）0.51±0.035）6）0.37±0.037）颅骨厚度/mm 0.20±0.02 0.21±0.01 0.27±0.011）2）0.37±0.032）3）0.44±0.023）4）0.51±0.034）5）0.90±0.035）6）0.79±0.056）7）

2.3 大鼠颅骨材料力学与骨质参数的相关性分析

所有大鼠极限载荷、压缩强度、压缩模量均与骨密度、骨体积、骨小梁厚度、颅骨厚度呈正相关（P＜0.05，表3）。

表3 大鼠颅骨材料力学与骨质参数相关性Tab. 3 Correlation between material mechanics and bone material parameters of rat skulls

3 讨论

目前，已有文献[14-17]报道利用颅骨形态学特征进行年龄推断。HENDERSON 等[14]研究认为，利用颅骨表面形态特征和颅骨骨缝结构参数进行年龄推断易受主观因素影响，年龄推断结果可能存在6～10 岁的误差，实际应用价值值得商榷。莫世泰等[15]研究了冠状缝、矢状缝和人字缝等的愈合情况，发现颅缝的愈合程度与年龄存在正相关，该结果在CHIBA 等[16-17]的研究中也得到了证实，上述结果与本研究发现的随着年龄增长，大鼠的颅缝由宽到窄直至融合呈现明显的增龄性变化规律相一致。

TORIMITSU 等[18]通过对116具尸体颅骨进行力学试验，发现其骨缝连接处破坏应力、破坏应力和颅骨厚度的平方比均与年龄存在相关性。LEE 等[6]的研究结果发现，颅骨的微观结构与力学参数间存在相关性。

本研究中，颅骨骨密度、骨体积和骨小梁厚度参数在52 周范围内与年龄呈正相关，具有较好的拟合度，提示可以利用上述骨质参数进行年龄推断。2、4、17、26、52、104 周龄大鼠分别与婴幼儿（0～2 岁）、学龄前儿童（3～5 岁）、学龄儿童（10～12 岁）、青少年（18～20 岁）、中年（35～40 岁）和老年（65～70 岁）人群相对应[19]，提示颅骨骨密度、骨体积和骨小梁厚度参数在推断中年及其以前人群年龄中具有优势。大鼠骨骼的快速生长发育多在26 周前，与人体骨骼发育相一致，故本研究分组的前期年龄间隔较短，后期较长，且各个具有代表性的年龄阶段均包括在内，对于探究人体各年龄阶段骨折相关情况[20]也具有参考价值。本研究结果与ZHANG 等[21-22]研究不同年龄段大鼠股骨微观结构参数变化趋势基本一致，但二者的拐点年龄存在差异，后者骨密度、骨体积和骨小梁厚度数值逐渐增长到9月龄时开始下降，且各骨参数呈双相变化，考虑造成拐点差异的原因可能是其分组间隔为1 月或2 月，与本研究的周龄分组不同。此外，研究的骨种类不同也是结论差异的重要原因。LILLIE 等[23]的研究也表明，随着年龄增长，颅骨厚度的总体趋势略有增加。本研究证实，随着年龄增长，颅骨逐渐增厚，至52 周达最大值，其后略有下降，提示颅骨厚度也可以用于法医学年龄推断。

不同周龄大鼠颅骨骨折类型及形态存在差异。本研究显示，低龄段的大鼠颅骨受压易发生骨缝分离，而随着年龄增长，受压部位由凹陷性骨折逐渐表现为孔状骨折。其原因可能是由于低龄大鼠颅骨弹性好，不易发生骨折，随着年龄的增长，颅骨的脆性增大而弹性降低，故容易发生与致伤物接触面形态类似的凹陷性骨折或粉碎性骨折。这与人类各年龄段人群骨折发生类型存在差异具有相似性。胎儿颅骨未完全闭合，通过自然分娩时受到母体产道的挤压，若胎儿过大或产道过窄时容易发生新生儿颅骨骨缝分离或出现“乒乓球骨折现象”[24]；婴幼儿和青少年四肢长骨受到外界暴力作用时，可能发生青枝骨折[25]；而中老年特别是老年人群骨骼在遭受损伤时比较容易发生错位性骨折或粉碎性骨折[26-28]。据文献[29-30]报道，随着年龄的增长，骨骼质量会降低，其基质成分、骨皮质孔隙率会发生变化，骨质变疏松导致脆性增加，更易发生骨折风险。

压缩试验发现，不同年龄大鼠颅骨骨折的失效阈值存在差异。在2～26 周，随着大鼠年龄增长，极限载荷、压缩强度和压缩模量呈明显增大趋势，与年龄呈正相关。大鼠颅骨压缩强度和压缩模量在骨骼发育期快速增大，在骨骼成熟期后增大幅度降低，可能与骨发育阶段皮质骨晶体结构疏松，呈板状结构，承载能力较弱有关。随着骨进入成熟期，纤维形成束状结构，其中矿物晶体紧密融合，具有较高的承载能力。随着时间的推移，骨骼中晶体成分沿胶原纤维呈横行生长，晶体变得非常细长，纤维变得更细、更脆，板状结构的某些部分甚至脱落，降低了大鼠颅骨弹性、抗压缩性等生物力学性能[31]。本研究以雄性大鼠为对象，控制了性别因素，单纯分析大鼠材料力学和骨质参数随年龄变化的趋势，易于对变化趋势进行分段拟合。结果提示，颅骨材料的极限载荷、压缩强度和压缩模量等生物力学参数在推断青少年、学龄儿童、学龄前儿童及婴幼儿人群的年龄中具有优势。

本研究中大鼠颅骨的骨密度、骨体积、骨小梁厚度及颅骨厚度等骨质参数均与其极限载荷、压缩强度、压缩模量等材料力学参数呈正相关，验证了颅骨的组织结构决定颅骨的力学性能观点。而年龄、性别以及影响成骨-破骨过程的生理和病理体质因素对机体骨骼的材料力学特性均具有重要的影响[32-33]。已有报道[34-35]表明，取材部位的不同，以及颅骨是否附着软组织[6，36]同样会影响其微观结构参数和材料力学参数，故在实验时一定要控制变量，对单一因素进行研究，结果会更加可靠。

综上所述，大鼠颅骨骨密度、骨体积、骨小梁厚度和颅骨厚度等骨质参数，以及极限载荷、压缩强度和压缩模量等材料力学参数均在一定范围内与年龄增长呈正相关。本研究结果为颅骨骨折生物力学失效阈值与骨质参数研究提供了基础数据，同时，证实颅骨材料力学与骨质参数的增龄性变化规律可在一定范围内为法医学年龄推断提供参考。