黄芩苷抗生物膜作用研究进展

韩佳慧， 刘唐娟， 罗 劲， 温中薇， 黄海珠， 张 珂， 蒋玉婷， 陈一强

(广西医科大学第一附属医院，广西 南宁 530021)

随着医学科学的发展，越来越多的医疗器械和人造器官等植入物用于治疗各种疾病，据报道，绝大多数的医疗器械或人造器官会导致生物膜相关的感染，包括导尿管、假牙、人工心脏瓣膜和假肢等[1]。生物膜的形成最初被认为是微生物的一种神秘行为，是微生物主要的生活方式。现定义为一个相互作用的微生物群落，紧密地、不可逆地锚定在一个表面，并嵌入到由胞外聚合物(EPS)组成的基质中[2-3]。通常治疗浓度下的抗生素无法根除生物膜结构深处的细菌/真菌，针对生物膜的抗生素疗法一般疗程长、剂量高，过度使用抗生素将引起抗生素耐药性的传播，随着多重耐药(MDR)、广泛耐药(XDR)和全耐药(PDR)病原体的出现，世界正处于后抗生素时代的边缘，这将使医学重新陷入黑暗时代，因此迫切需要开发能够调节生物膜形成和发育的新型抗菌剂，以克服微生物感染性疾病中的耐药问题[4-5]。近年来的研究表明中药及其活性成分能抑制生物膜的形成和发育，如五倍子水煎剂可抑制鲍曼不动杆菌生物膜形成；土荆芥提取物可抑制幽门螺杆菌生物膜形成；桑黄正丁醇提取物可抑制白念珠菌生物膜形成；隐丹参酮可抑制表皮葡萄球菌生物膜等[6-10]。关于中药活性成分抑制生物膜形成已有大量报道，其中黄芩作为现代药理学研究的热点，其活性成分黄芩苷也成为近些年研究的明星化合物。

黄芩始载于《神农本草经》，别名山茶根、土金茶根，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，味苦，性寒，归肺、胆、脾、小肠、大肠经，其有效成分是黄酮类化合物，主要包括黄芩苷(baicalin)、黄芩素(baicalein)、汉黄芩苷(wogonoside)、汉黄芩素(wogomin)、黄芩新素I(skullcapflavone I)、黄芩新素Ⅱ(skullcapflavone Ⅱ)[11]。黄芩苷是黄芩的药效物质基础，也是黄芩质量控制的主要植物化学标志，具有抗病毒、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、保肝、利胆、免疫调节等多种药理作用，尤以抗真菌/细菌作用最为显著[12]。本文将近年来黄芩苷抗生物膜作用的研究进展进行综述，以期进一步深入挖掘其在抗生物膜方面的潜在价值，为治疗生物膜相关感染提供新的治疗策略。

1 抗细菌生物膜

生物膜的形成是一个复杂的发育过程，主要分为初始粘附阶段、早期生物膜形成阶段、生物膜成熟阶段、扩散与再定植阶段[13]。生物膜的形成是细菌引发慢性感染的关键毒力因子，为细菌提供了有利于生存的惰性环境，由于细菌特有的生活方式赋予了其固有的抗生素抗性，因此治疗生物膜相关感染成为全球面临的一大挑战[14]。大量研究表明中药黄芩活性成分黄芩苷具有抑制细菌生物膜的作用。

1.1 抗金黄色葡萄球菌生物膜 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, Sa)是革兰氏阳性菌，常分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)，主要存在于皮肤和黏膜的正常菌群中[15]。金黄色葡萄球菌能形成成熟的生物膜，与浮游细菌相比，生物膜内的细菌对抗生素的耐受性可以高出1 000倍[15]。本课题组利用临床分离并且能够稳定形成生物膜的金黄色葡萄球菌，研究黄芩苷对金黄色葡萄球菌早期、成熟生物膜的抑制作用，采用TSB-G系统构建体外生物膜模型，实验测得黄芩苷对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)为2 048 μg/mL，黄芩苷可减少金黄色葡萄球菌对载体的黏附，抑制和清除金黄色葡萄球菌生物膜，同时还能抑制新的生物膜形成[16-17]。在后期研究中发现黄芩苷与抗生素具有协同增效作用，黄芩苷与头孢他啶[18]、头孢唑林[19]、左氧氟沙星[20]、万古霉素[21]等联用，能加速破坏生物膜的结构，增强抗生素的渗透以及对细菌的清除作用，显示出了协同杀菌作用，与其干扰了细菌群体感应(Quorum Sensing, QS)系统密切相关。在观察黄芩苷与左氧氟沙星联用抗生物被膜感染的疗效时，发现黄芩苷作为QS抑制剂，在体外可提高金黄色葡萄球菌热核酸酶的产量，下调agrA的表达，通过agr系统来调节金黄色葡萄球菌的毒力因子[22]。基于这些研究，黄芩苷可作为治疗金黄色葡萄球菌生物膜相关感染的候选药物，与抗生素联用可作为新的、可行的治疗策略。

1.2 抗铜绿假单胞菌生物膜 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，Pa)是机会性致病菌，是囊性纤维化患者持续性和顽固性感染的主要原因[23]。

谢林利等[24]发现黄芩苷、黄芩素对铜绿假单胞菌生物膜的形成具有抑制作用，对早期生物膜的抑制作用强于成熟生物膜。王贵年等[25-26]选取临床分离的铜绿假单胞菌，研究黄芩苷在体外对铜绿假单胞菌生物膜的影响，结果发现浓度为15.65 mg/L的黄芩苷可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，并增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的清除作用。Brackman等[27]在探索群体感应抑制剂(QSI)在体内外增加抗生素对细菌生物膜的敏感性研究中，发现黄芩苷通过增加妥布霉素 (TOB)对铜绿假单胞菌生物膜的敏感性来抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，但敲除参与QS调控的rhlI基因、lasI基因后，黄芩苷不能增加TOB对铜绿假单胞菌生物膜的敏感性，进而说明黄芩苷可通过影响群体感应系统提高抗生素对细菌生物膜的抑制与清除作用。Luo等[28]发现黄芩苷在体内外均可抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成，对QS通路调控的与生物膜形成相关的基因有明显的抑制作用，亚MIC黄芩苷处理后，LasI、LasR、rhLI、rhLR、pqsR和pqsA基因的表达均下调，从而使QS信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL的表达显著降低，体内实验表明，黄芩苷处理后不仅可降低铜绿假单胞菌对秀丽隐杆线虫的致病性，在小鼠腹腔植入感染模型中，黄芩苷处理后，还提高了感染铜绿假单胞菌的小鼠对铜绿假单胞菌的清除能力。李少滨等[29]取铜绿假单胞菌 PAO1标准株，用黄芩苷对铜绿假单胞菌 PAO1生物膜的体外培养进行干预，结果显示黄芩苷不仅抑制生物膜的形成，还降低多糖蛋白复合物的产量，抑制mRNA的表达效果，同时也说明黄芩苷抑制生物膜生成的机制存在多靶点，具体的作用机制仍需深入探索。

1.3 抗其他细菌生物膜 变形链球菌 (Streptococcusmutans, Sm) 是引起口腔致龋的主要致病菌。刘连等[30]发现黄芩苷、黄芩素对变形链球菌无直接杀灭作用，但可显著抑制其生物膜的形成，有利于避免细菌抗药性的产生。

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis, Pg) 是慢性牙周炎最常见的致病菌，张广平[31]采用PVC吸痰管作为载体建立体外生物膜模型，实验测得32.25 mg/L的黄芩苷可抑制和破坏牙龈卟啉单胞菌生物膜，其抑制机制可能通过抑制细菌的黏附作用。

粪肠球菌(Enterococcusfaecalis, Ef)是普遍存在于人体的肠道和口腔中的正常菌群，由于其以生物膜的形式定植于根管中，所以成为再治疗根管中常见的难治性问题。付爽等[32]测得黄芩苷对粪肠球菌的MIC为2 mg/mL，MBC为4 mg/mL，共聚焦显微镜观察膜内活菌和死菌比例明显下降，提示黄芩苷可抑制粪肠球菌生物膜的形成。

洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia, Bc)是一种革兰阴性非发酵杆菌，广泛存在于自然和医疗环境中，洋葱伯克霍尔德菌感染会加速囊性纤维化(CF)患者肺功能衰竭，同时会增加死亡率[33]。Slachmuylders等[34]在实验中发现与单独使用妥布霉素相比，同黄芩苷联用后会增加洋葱伯克霍尔德菌生物膜的氧化压力，也可增强洋葱伯克霍尔德菌对妥布霉素的敏感性，使妥布霉素介导的杀伤力增加。这种增强作用与氧化应激反应有关，使活性氧的产生增多。

阪崎克罗诺杆菌(Cronobactersakazakii, Cs)是近些年新分类出的一种机会性病原体，为肠杆菌科克罗诺杆菌属，常导致严重的感染并发症，如新生儿脑膜炎、尿路感染、败血症和癫痫等，阪崎克罗诺杆菌能在各种生物及非生物表面形成生物膜。景春娥等[35]测得2 048 mg/L黄芩苷能够通过降低阪崎克罗诺杆菌的粘附性，下调阪崎克罗诺杆菌生物膜相关基因(glpQ、nlpD、gsiB、deoB)来抑制生物膜的形成。

Wang等[36]发现黄芩苷还能有效地抑制腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus, Ss)生物膜的形成及agr系统，具体机制是通过抑制Msra外排泵，外排泵与生物膜的形成之间呈显著的正相关。黄衍强等[37]发现黄芩苷对耐药幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)有抑制作用, 浓度<50%MIC能明显抑制菌株生物膜的形成。

2 抗真菌生物膜

真菌可以单独或与细菌一同形成生物膜，真菌生物膜的形成与细菌相似，真菌生物膜是由附着在表面上的细胞和菌丝组成的复杂群落，并嵌入细胞外基质中。近年来，与生物膜相关的侵袭性真菌感染病例不断增多，尤以白色念珠菌和烟曲霉菌感染率最高，生物膜的形成参与了侵袭性真菌感染的致病过程，因此被认为是重要的毒力因子[38]。目前只有几类抗真菌药物用于治疗真菌感染，而新型抗真菌药物的开发进展缓慢，故从中药中挖掘具有抗生物膜作用的中药活性成分显得尤为重要。我国具有丰富的中药资源，其中有不少中草药已被证明具有抗真菌生物膜作用，如中药黄芩活性成分黄芩苷[39]。

2.1 抗白色念珠菌生物膜 念珠菌是引起侵袭性真菌感染最常见的病原菌，其中白色念珠菌(Candidaalbicans, Ca)是引起侵袭性念珠菌病的主要病原体。白色念珠菌是口腔或胃肠道中的共生菌，然而当机体免疫功能严重受损时，这种真菌可以传播到血液中并定植于内脏，导致危及生命的感染[40]。白色念珠菌生物膜是一种复杂的结构，包含酵母状细胞、假菌丝细胞和菌丝细胞，这些细胞被包裹在细胞外基质中，细胞外基质对抗真菌药物起着物理屏障的作用，现有的抗真菌药物在对浮游菌有效的浓度下，对生物膜中的白色念珠菌基本上无效，虽然高浓度的药物可清除生物膜结构深处的白色念珠菌，但这些剂量往往会对宿主产生严重的副作用(即肾脏或肝脏损伤)[41-42]。黄芩及其有效成分对浮游状态的白色念珠菌的抑制作用已有大量报道，黄芩苷具有抑制白色念珠菌生物膜形成的作用。

李福明等[43]研究黄芩苷在体外对白色念珠菌生物膜形成的影响，结果显示黄芩苷可抑制白色念珠菌生物膜的形成，在质量浓度为8.0 mg/mL时，白色念珠菌生物膜活性降低(90.6±5.2)%，生物膜生物量减少(90.3±2.6)%。黄芩苷在抗白色念珠菌生物膜时与氟康唑具有协同增效作用。颜贵明等[44]发现黄芩苷联合氟康唑时对白色念珠菌生物膜的抑制作用加强，通过下调白色念珠菌生物膜相关基因(ALS1、ALS3、EAP1和SUN41)的表达，降低细胞表面疏水性调控基因CSH1，从而减弱白色念珠菌的毒力，发挥协同抗白色念珠菌生物膜的作用。

Wang等[45]研究黄芩苷对白色念珠菌生物膜的潜在作用机制时，发现黄芩苷不仅与氟康唑具有明显的协同作用，还可能逆转了白色念珠菌对氟康唑的耐药性，同时在黄芩苷处理的白色念珠菌生物膜中观察到细胞内活性氧(ROS)积累，线粒体膜电位(MMP)降低，磷脂酰丝氨酸(PS)外化，染色体凝聚，细胞核碎裂，细胞色素C(Cytc)释放等凋亡相关的现象；通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)发现黄芩苷处理后RAS1/TPK1上调、CAP1/PDE2下调，这四个基因与Ras-cAMP-PKA通路相关，该通路调控着白色念珠菌的凋亡。关于细胞凋亡在黄芩苷抗白色念珠菌生物膜中的作用机制仍需进一步探讨。

2.2 抗非白色念珠菌生物膜 汪长中等[46]研究了黄芩苷对光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌生物膜的作用，测得黄芩苷对4种非白念珠菌生物膜的SMIC50分别是 1 000、500、125、250 mg/L，SMIC80均≥1 000 mg/L，具有体外抗非白念珠菌生物膜的功能。因此，针对临床上可能发生念珠菌生物膜感染疾病的患者，在未出现感染或感染的早期阶段应用黄芩苷具有重要的防治意义。

3 结语

广谱抗菌药的使用，导致了大量耐药菌株的出现，生物膜的形成增强了微生物对不利因素的抵抗能力。中药在防治细菌/真菌生物膜相关感染方面有其独特的优势，黄芩为中医临床常用药，具有广泛的药理作用和重要的临床应用价值，黄芩苷可通过抑制细菌或真菌的粘附、下调生物膜形成相关基因，抑制群体感应系统、调控细胞凋亡、改变细胞膜通透性等多种途径达到抑制生物膜形成的作用，与抗生素联用还具有协同增效作用和逆转耐药性的作用。尽管黄芩苷抗生物膜作用已取得一定的进展，但仍需深入的研究其作用机制，以明确其抗生物膜作用的靶点，通过对中药黄芩活性成分黄芩苷抗生物膜作用的系列研究，从而建立一种模式，以延伸到其他中药对生物膜抑制作用的研究中，更好地促使中药在这一领域的开发，为研发新型抗菌药物开辟新途径，为临床防治生物膜相关感染策略提供参考。目前市面上的黄芩苷新型制剂主要有纳米制剂、固体分散体、脂质体制剂、 磷脂复合物、β-环糊精包合物、金属配合物等，但临床上应用于生物膜相关感染的黄芩苷制剂比较少，今后应将该成分基础研究转化为临床效益，研发出抗生物膜制剂，充分发挥其特色优势，使广大患者获益。