真姬菇次生代谢产物化学成分的研究

蔡 旭，肖 咪，薛宏坤，邹先伟，唐劲天*

（1.清华大学工程物理系，教育部粒子与辐射成像重点实验室，北京 100084；2.华中科技大学协和江北医院，武汉市蔡甸区人民医院药剂科，湖北 武汉 430065）

药食两用真菌是我国中医药宝库的重要组成部分，具有数千年的应用历史，为人们提供了大量的食品药品资源。真菌的代谢产物是其功效及防治疾病的重要物质基础，其资源丰富，提供了众多安全、有效的活性分子，通过菌种诱变、培养条件、代谢调控等方法优化，药食两用真菌可产生结构新颖、种类丰富、生物活性独特的次生代谢产物，而且大多具有再生性，例如从侧耳属菌中分离得到截短侧耳素类、新骨架eryngiolide A、双萘并吡喃酮等类型活性成分［1-3]，从牛樟芝Antrodia camphorata中分离得到三萜、马来酸衍生物、安卓奎诺尔等活性成分［4-5]，从金针菇Flammulina velutiper 次生代谢产物中分离得到花侧柏烷型单萜化合物enokipodins A～D 等［6]。

真姬菇Hypsizygus marmoreus（Peck）H.E.Bigelow 属于离褶伞科玉蕈属真菌，又名海鲜菇、斑玉蕈、蟹味菇等，主要分布于日本、中国、北欧等地，富含蛋白质、必需氨基酸、微量元素等，具有独特的蟹香味，是一种营养价值较高的药食两用真菌［7]。目前对真姬菇的研究大多局限于其品种、栽培、提取物活性、提取工艺等，对其化学成分报道较少［8-13]，仅分离到具有抗氧化、抗肿瘤活性的β-（1-3）-D-葡聚糖［14]，抑制 HepG2 细胞的hypsiziprenol A9，人白血病U937 细胞的糖蛋白HM-3A［15-16]。为了更深入地开发利用真姬菇，本实验对其进行大米固体发酵后，用乙酸乙酯提取其次生代谢产物，从中分离鉴定了11 个化合物，均为首次从玉蕈属真菌次生代谢产物中分离得到。

1 材料

AvanceⅢ400-NMR 超导核磁共振仪（德国Bruker BioSpin 公司）；Agilent 6520 Q-TOF 质谱仪（美国Agilent 公司）；Dionex Ultimate 3000 液相色谱仪（美国Dionex 公司）；赛普锐斯中压液相色谱仪（赛普锐斯北京科技有限公司）；柱色谱硅胶（100～200、200～300 目）、硅胶薄层板GF254（青岛海洋化工厂）；RP-C18色谱填料、HPLC 制备柱（250 mm×20 mm，5 μm，日本YMC 公司）。液相用纯净水（实验室自制）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯（北京市通广精细化工公司）；色谱纯甲醇（美国Sigma 公司）。RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ZF-2三用紫外仪（上海市安亭电子仪器厂）。

真姬菇菌种于2018 年购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC®），编号CICC50078，收藏于清华大学医学物理与工程研究所。

2 提取与分离

将菌株接种到经高压灭菌的PDA 平板培养基（马铃薯葡萄糖琼脂，PDA）在25 ℃下活化培养7 d后，接种至250 mL 培养瓶，每瓶50 mL，液体培养基（0.4% 葡萄糖、1% 麦芽提取物、0.4% 酵母提取物）在25 ℃下培养7 d，配制15 瓶（大米80 g、水120 mL），121 ℃高压灭菌锅灭菌25 min后备用。从液体培养基中接种适量种子培养物到灭菌后的三角瓶中，放置于培养架上，室温下培养21 d。

发酵完成后，分别用2 倍体积200 mL 石油醚、乙酸乙酯对每瓶发酵产物萃取3 次，滤过，合并滤液，浓缩，得到乙酸乙酯粗提物10.3 g。将乙酸乙酯粗提物（14.6 g）经RP-C18色谱柱，用水、20%、40%、60%、95%甲醇各2.0 L 依次梯度洗脱，收集馏分，每瓶100 mL，薄层硅胶板检测合并馏分，减压回收甲醇，干燥，得到5 个馏分（Fr.A～Fr.E）。Fr.B 分别用石油醚、二氯甲烷、甲醇、二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，滤过，得化合物1（0.73 g）；Fr.E 经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱，薄层硅胶板检测合并馏分，经石油醚-二氯甲烷（10∶1～2∶1）梯度洗脱，得到3 个亚组分Fr.E1～E3。Fr.E1 经过制备型HPLC 甲醇-水（80∶20～90∶10）梯度洗脱，得化合物2（2.5 mg）、3（4.5 mg）；Fr.E2 经制备型HPLC 甲醇-水（85∶15～95∶5）梯度洗脱，得化合物4（4.8 mg）、5（3.4 mg）、6（8.9 mg）、7（6.8 mg）、8（1.8 mg）、9（1.9 mg）；Fr.E3 经过硅胶石油醚-二氯甲烷（1∶1）洗脱得化合物10（3.8 mg）、11（3.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈灰色；EI-MS m/z：462.654 1 ［M +H]+，分子式C29H40N3O2。1H-NMR（400 MHz，C5D5N） δ：7.71（1H，s，H-4），7.06（1H，s，H-6），3.36（2H，td，J=14.5，3.1 Hz，H-8），4.09（1H，ddd，J=8.4，4.2 Hz，H-9），6.28（1H，dd，J=17.4，10.5 Hz，H-16），5.14（1H，dd，J=17.4，10.5 Hz，H-17），1.54（3H，s，H-18），1.54（3H，s，H-19），3.59（4H，m，H-20，25），5.46（1H，t，J=7.3 Hz，H-21），5.60（1H，t，J=7.4 Hz，H-26），1.73（3H，s，H-28），1.73（3H，s，H-29）；13C-NMR（100 MHz，C5D5N） δ：141.7（C-2），106.4（C-3），130.2（C-3a），115.7（C-4），130.8（C-5），122.1（C-6），123.9（C-7），132.1（C-7a），32.3（C-8），56.7（C-9），56.7（C-10），168.4（C-11），51.4（C-12），21.5（CH3-12），168.4（C-14），39.3（C-15），146.8（C-16），111.3（C-17），28.1（C-18），28.1（C-19），34.9（C-20），125.4（C-21），133.1（C-22），17.5（C-23），25.4（C-24），34.9（C-25），123.0（C-26），133.1（C-27），25.4（C-28），17.5（C-29）。以上数据与文献［17] 基本一致，故鉴定为灰绿曲霉素。

化合物2：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈黄绿色；EI-MS m/z：322.380 4 ［M+Na]+，分子式C19H22O3Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.48（1H，s，H-4），11.73（1H，s，6-OH），6.75（1H，s，H-7），6.35（1H，d，J=15.8 Hz，H-9），6.54（1H，m，H-10），2.27（2H，m，H-11），1.57（2H，m，H-12），1.00（3H，t，J=7.4 Hz，H-13），10.26（1H，s，H-14），3.43（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.37（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.81（3H，s，H-18），1.74（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：110.8（C-1），128.6（C-2），148.4（C-3），119.4（C-4），126.4（C-5），157.6（C-6），98.9（C-7），157.6（C-8），118.4（C-9），135.4（C-10），35.0（C-11），22.1（C-12），13.7（C-13），193.0（C-14），27.5（C-15），121.3（C-16），134.0（C-17），25.8（C-18），17.8（C-19）。以上数据与文献［18-19] 基本一致，故鉴定为2-（3，8-环氧-7，9-庚二烯基）-6-羟基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物3：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；EI-MS m/z：296.374 4［M]+，分子式C19H20O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.48（1H，s，H-4），11.75（1H，s，6-OH），6.82（1H，s，H-7），6.34（1H，d，J=15.5 Hz，H-9），6.97（1H，dd，J=15.5，10.8 Hz，H-10），6.25（1H，t，J=15.5 Hz，H-11），6.00（1H，dq，J=14.0，6.8 Hz，H-12），1.89（3H，d，J=6.6 Hz，H-13），10.27（1H，s，H-14），3.44（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.37（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.81（3H，s，H-18），1.75（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：112.8（C-1），128.1（C-2），156.9（C-3），118.8（C-4），126.4（C-5），156.7（C-6），102.9（C-7），147.3（C-8），116.5（C-9），134.1（C-10），131.0（C-11），131.4（C-12），18.2（C-13），194.0（C-14），27.5（C-15），121.6（C-16），134.4（C-17），25.5（C-18），18.0（C-19）。以上数据与文献［18-19] 基本一致，故鉴定为2-（3，8-环氧-7，9，11-庚三烯基）-6-羟基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物4：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；ESI-MS m/z：301.179 4 ［MH]-，分子式 C19H24O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.91（1H，s，H-4），11.97（1H，s，6-OH），2.98（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.31（2H，m，H-8），5.48（1H，m，H-9），5.48（1H，m，H-10），1.97（2H，m，H-11），1.36（2H，dt，J=14.6，7.3 Hz，H-12），0.89（3H，t，J=7.4 Hz，H-13），10.25（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.3 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.0（C-3），125.8（C-4），127.5（C-5），155.8（C-6），24.2（C-7），34.1（C-8），128.3（C-9），132.6（C-10），34.6（C-11），22.5（C-12），13.6（C-13），195.6（C-14），27.0（C-15），121.1（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上数据与文献［20] 基本一致，故鉴定为2-（E-3-庚烯基）-3，6-二羟基-5-（17-甲基-2-丁烯基）苯甲醛。

化合物5：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；ESI-MS m/z：301.179 8 ［MH]-，分子式 C19H25O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.95（1H，s，H-4），2.94（2H，t，J=8.4 Hz，H-7），2.03（2H，m，H-8），1.31（2H，m，H-9），1.51（2H，m，H-10），5.44（1H，m，H-11），5.44（1H，m，H-12），1.64（3H，d，J=4.5 Hz，H-13），10.28（1H，s，H-14），3.27（2H，d，J=7.5 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=6.0 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.5（C-1），128.6（C-2），145.1（C-3），125.8（C-4），128.7（C-5），156.2（C-6），24.0（C-7），31.6（C-8），29.8（C-9），32.6（C-10），133.4（C-11），125.6（C-12），17.6（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上数据与文献［21] 基本一致，故鉴定为isotetrahydroauroglaucin。

化合物6：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；ESI-MS m/z：299.165 0 ［MH]-，分子式 C19H23O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.95（1H，s，H-4），11.95（1H，s，6-OH），3.0（2H，t，J=7.7 Hz，H-7），2.36（2H，q，J=7.4，6.7 Hz，H-8），6.03（1H，m，H-9），5.61（1H，dp，J=13.7，6.8 Hz，H-10），6.03（1H，m，H-11），5.61（1H，dp，J=13.7，6.8 Hz，H-12），1.75（3H，d，J=6.8 Hz，H-13），10.23（1H，s，H-14），3.31（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.71（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），24.1（C-7），34.2（C-8），128.1（C-9），131.9（C-10），129.5（C-11），131.2（C-12），18.1（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.7（C-19）。以上数据与文献［22] 基本一致，故鉴定为异二氢金（色）灰绿曲霉素。

化合物7：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；ESI-MS m/z ：303.196 5 ［MH]-，分子式 C19H27O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：4.49（1H，s，3-OH），6.92（1H，s，H-4），11.95（1H，s，6-OH），2.91（2H，t，J=7.9 Hz，H-7），1.60（2H，m，H-8），1.33（8H，m，H-9，10，11，12），0.90（3H，t，J=6.6 Hz，H-13），10.28（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），24.1（C-7），34.2（C-8），128.1（C-9），131.9（C-10），129.5（C-11），131.2（C-12），18.1（C-13），195.6（C-14），27.1（C-15），121.2（C-16），133.8（C-17），17.8（C-18），25.7（C-19）。以上数据与文献［20-21] 基本一致，故鉴定为灰绿曲霉黄色素。

化合物8：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；EI-MS m/z：339.188 5 ［M+Na]+，分子式C19H24O4Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：6.98（1H，s，H-4），12.01（1H，s，6-OH），3.12（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.25（1H，m，H-8），2.02（1H，m，H-8），4.50（1H，t，J=7.4 Hz，H-9），5.87（1H，dd，J=15.7，5.5 Hz，H-10），5.95（1H，dd，J=15.7，5.5 Hz，H-11），4.41（1H，q，J=6.2 Hz，H-12），1.34（3H，d，J=6.4 Hz，H-13），10.24（1H，s，H-14），3.31（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.71（3H，s，H-18），1.77（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：116.5（C-1），120.4（C-2），146.8（C-3），126.3（C-4），129.6（C-5），155.1（C-6），19.9（C-7），27.3（C-8），74.8（C-9），127.7（C-10），137.6（C-11），66.4（C-12），23.2（C-13），195.7（C-14），26.3（C-15），121.8（C-16），132.6（C-17），24.3（C-18），16.9（C-19）。以上数据与文献［18] 基本一致，故鉴定为毛壳菌吡喃宁。

化合物9：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；EI-MS m/z：337.149 4 ［M+Na]+，分子式C19H22O4Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.00（1H，s，H-4），12.03（1H，s，6-OH），3.15（2H，t，J=7.5 Hz，H-7），2.25（1H，m，H-8），1.96（1H，m，H-8），4.71（1H，m，H-9），6.43（1H，dd，J=16.0，1.7 Hz，H-10），6.85（1H，dd，J=16.0，1.7 Hz，H-11），2.34（3H，s，H-13），10.24（1H，s，H-14），3.33（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=7.4 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19），12.01（1H，s，6-OH）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：116.5（C-1），119.4（C-2），145.8（C-3），127.3（C-4），130.6（C-5），156.7（C-6），20.0（C-7），26.8（C-8），73.8（C-9），144.2（C-10），130.5（C-11），196.8（C-12），27.6（C-13），194.2（C-14），26.3（C-15），121.8（C-16），132.6（C-17），24.3（C-18），16.9（C-19）。以上数据与文献［19] 基本一致，故鉴定为6′-oxo-chaetopyranin。

化合物10：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；EI-MS m/z：323.400 7 ［M+Na]+，分子式C19H22O3Na。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.03（1H，s，H-4），11.73（1H，s，6-OH），6.52（1H，1H，d，J=16.3 Hz，H-7），6.47（1H，dd，J=16.3，10.1 Hz，H-8），6.30（1H，dd，J=14.7，10.1 Hz，H-9），5.92（1H，dt，J=14.7，7.5 Hz，H-10），2.17（2H，dd，J=13.9，6.7 Hz，H-11），1.48（2H，dt，J=13.9，7.0 Hz，H-12），0.97（3H，t，J=7.3 Hz，H-13），10.11（1H，s，H-14），3.34（2H，d，J=7.4 Hz，H-15），5.32（1H，t，J=3.0 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.3（C-1），128.8（C-2），145.3（C-3），126.0（C-4），127.6（C-5），155.7（C-6），118.1（C-7），137.9（C-8），129.5（C-9），138.2（C-10），34.2（C-11），24.0（C-12），13.6（C-13），195.6（C-14），29.7（C-15），121.1（C-16），133.8（C-17），17.7（C-18），25.7（C-19）。以上数据与文献［22] 基本一致，故鉴定为二氢金（色）灰绿曲霉素。

化合物11：黄色固体，10% 硫酸乙醇，加热105 ℃，呈墨绿色；ESI-MS m/z：301.167 7 ［MH]-，分子式 C19H25O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3） δ：7.01（1H，s，H-4），11.94（1H，s，6-OH），6.56（1H，d，J=8.7 Hz，H-7），6.03（1H，m，H-8），2.35（2H，dd，J=7.7，1.8 Hz，H-9），1.52（2H，q，J=7.7，1.8 Hz，H-10），1.35（4H，m，H-11，12），0.97（3H，t，J=7.2 Hz，H-13），10.03（1H，s，H-14），3.32（2H，d，J=7.3 Hz，H-15），5.30（1H，t，J=7.3 Hz，H-16），1.72（3H，s，H-18），1.79（3H，s，H-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3） δ：117.1（C-1），129.7（C-2），144.8（C-3），125.2（C-4），124.6（C-5），155.3（C-6），120.3（C-7），142.6（C-8），34.0（C-9），28.5（C-10），31.6（C-11），22.4（C-12），14.0（C-13），195.9（C-14），27.0（C-15），121.0（C-16），133.7（C-17），17.8（C-18），25.8（C-19）。以上数据与文献 ［20] 基本一致，故鉴定为曲霉素。

4 讨论

本研究从真姬菇大米发酵的乙酸乙酯提取物中分离鉴定出11 个化合物，主要为苯甲醛类衍生物。苯甲醛类衍生物已从冠突散囊菌 Eurotium cristatum、海洋真菌 Aspergillus sp 和 Asperillus glaucus HB1-19 等中分离获得，并具有较强的抗氧化、抗炎等活性［20，23-24]。本研究首次从药食两用真菌——真姬菇次生代谢产物中分离得到苯甲醛类衍生物，以期丰富玉蕈属真菌次生代谢产物的化学成分及其种类，为药食两用真菌资源的开发提供参考。