乳杆菌抑制幽门螺杆菌感染的分子机制

于婷，张丽红，翟玉香，王莉莉，董全江，栾淑芳

（1.青岛大学附属青岛市市立医院 中心实验室，山东 青岛266071；2.烟台毓璜顶医院消化内科，山东 烟台264000）

乳杆菌为革兰阳性、兼性厌氧的杆状细菌，能发酵己糖产生乳酸。乳杆菌属由两百多个种和亚种组成，在不同环境中广泛分布，如发酵食品、植物表面、口腔和粪便等[1]。其也是人类消化系统、泌尿系统和生殖系统中微生物群落的重要组成部分[2]。幽门螺杆菌（helicobacter pylori, Hp）是高感染率的致病菌，全球约一半的人口被感染，可定植在人类胃黏膜中，导致上消化道疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌[3]。临床通常采用基于抗生素的标准三联（质子泵抑制剂+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林）或四联（铋剂+质子泵抑制剂+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林）疗法根除。

但近年来由于抗生素的广泛使用，幽门螺杆菌耐药率上升，导致Hp 根除率持续下降（从92.2%下降到80.2%）。特别是克拉霉素耐药率在日本和意大利已升至约30%，土耳其约为40%，中国约为50%[4]。另外，甲硝唑耐药率也一直呈上升趋势。因此，亟需新的治疗方案达到Hp 理想根除率。作为共生菌，乳杆菌通常被认为是安全、非致病性的。多种乳杆菌被认为有益生作用，能够调节胃肠道菌群、改善胃肠道功能，包括嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德氏乳杆菌、植物乳杆菌和短乳杆菌等。乳杆菌作为益生菌的特性是其对酸性环境的耐受性强，对胃黏膜的黏附能力好；另外，它们对宿主有益，能产生抗菌物质，对上皮细胞起到屏障保护和免疫调节的作用[5]。因此，乳杆菌成为当前预防和抑制Hp 感染的研究热点。本文通过综述乳杆菌在不同临床研究中抗Hp 效果以及抑制Hp 感染的分子机制，以期筛选出高效抗Hp 的乳杆菌菌株，提高乳杆菌联合抗生素根除Hp 的临床疗效。

1 不同乳杆菌菌株抑制Hp的作用

由于传统抗生素对Hp 根除率逐渐降低，益生菌成为治疗方案中的重要补充。临床多以嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和加氏乳杆菌等乳杆菌为研究热点。ZIEMNIAK[6]涉及641 例Hp 感染患者的研究中，采用嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的三联疗法组对Hp 的根除率提高8.4%。另一项研究中将我国100 例Hp 感染伴有消化道症状的儿童作为治疗组，采用标准三联疗法（儿童每日给药剂量为质子泵抑制剂0.6～0.8 mg/kg，克拉霉素30～50 mg/kg，阿莫西林30～50 mg/kg 或甲硝唑15～20 mg/kg）并补充益生菌（嗜酸乳杆菌La5 和乳双歧杆菌）2 周，然后再单独补充益生菌4 周，结果提升，治疗组相比对照组根除率显著升高[7]。一项涉及234 例Hp 阳性的胃炎或消化不良患者的随机开放性研究发现，与标准疗法（奥美拉唑20 mg，克拉霉素500 mg，阿莫西林1 000 mg 连续给药7 d）相比，乳杆菌预处理2 周或抗生素治疗后继续服用乳杆菌，Hp 根除率均提高约20%[8]。SHEU 等[9]对138 例前期Hp 根除失败的十二指肠溃疡或胃炎患者采用抗生素四联疗法（阿莫西林1 g，甲硝唑500 mg，奥美拉唑20 mg、2 次/d，枸橼酸铋120mg、3 次/d）7 d 并联合益生菌（嗜酸乳杆菌La5 和乳双歧杆菌）治疗4 周后，通过意向性治疗分析，Hp 的根除率从71.7%提高到85.0%；通过遵循研究方案分析，根除率从76.6%升高到90.8%。在DEGUCHI 等[10]对229 例Hp 感染患者的随机对照研究中发现，标准三联疗法（雷贝拉唑10 mg，阿莫西林750 mg，克拉霉素200 mg，2 次/d，连续7 d）联合加氏乳杆菌OLL2716 片剂（连续服用4 周）治疗组的Hp 根除率显著高于标准三联疗法组。此外，一项评估益生菌抑制Hp 感染的有效性和安全性的Meta 分析研究发现，在使用抗生素治疗前和整个治疗过程中补充益生菌能够提高Hp 药物根除率并减少副作用，补充益生菌2周以上，药物疗效更好[11]。然而，并非所有的临床研究结论一致，MEDEIROS 等[12]招募62 例患有消化溃疡的Hp 阳性患者，比较抗生素三联治疗组（埃索美拉唑20 mg，阿莫西林1 000 mg，克拉霉素500 mg，连续治疗8 d）和嗜酸乳杆菌联合抗生素治疗组之间Hp 根除率有无差异，结果发现，添加嗜酸乳杆菌并没有提高抗生素根除Hp 的疗效。另一项107 例Hp 感染的消化溃疡和功能消化不良的巴西人群研究中，患者使用益生菌（嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌）联合抗生素治疗Hp，治疗7 d、30 d 后随访，结果发现两组之间Hp 的根除率没有明显差异[13]。造成研究差异的原因可能是受试菌株不一致。

研究证实，嗜酸乳杆菌La5、鼠李糖乳杆菌和加氏乳杆菌OLL2716 等乳杆菌联合抗生素三联或四联疗法能提高Hp 根除率。然而，仍有10%～15%患者Hp 根除失败。各临床研究中Hp 根除效果有差异，可能与乳杆菌菌株特异性、受试者数量、地理区域、给药时间不同有关。

2 乳杆菌抗Hp的分子机制

乳杆菌对Hp 具有抑制作用已得到较多研究的证实，但其潜在的作用机制仍需深入研究。目前认为乳杆菌抑制Hp 感染的可能分子机制包括细菌素的直接杀菌、黏附抑制、胃肠道微生物群调节和炎症抑制等。

2.1 乳杆菌产生细菌素杀灭Hp

细菌素是由细菌（包括乳杆菌）合成的一种30～60 个氨基酸组成的、耐热稳定的抗菌肽或肽毒素，对同一种属（窄谱）或不同种属（宽谱）的细菌具有杀伤活性[14]。根据细菌素生化特性分为3 类：Class Ⅰ细菌素（羊毛硫抗生素）以翻译后修饰为特征，如Nisin、Lactocin 和Mersacidin。ClassⅡ细菌素是分子量<10 kDa、未经修饰、疏水的一类小分子肽，它分为Class Ⅱa 和Class Ⅱb 两个亚类。Class Ⅱa 具有抗李斯特菌活性，如Pediocin Pa1和Leucocin A；Class IIb 需2 个互补肽协同作用发挥抗菌活性，如Plantaricin A 和Enterocin X。Class Ⅲ细菌素是分子量>30 kDa、耐热的大分子肽，如Lysostaphin 和Helveticin J[15]。JUNG 等[16]根据结构和作用机制不同，将细菌素分为A 类和B 类。A 类细菌素为螺旋结构，在细菌膜上形成电位依赖性空隙；B 类细菌素为球形结构，抑制细菌细胞壁形成。细菌素的产生在细菌竞争中发挥重要作用，使生产菌株具有生存优势。研究证明乳杆菌在上清液中产生的细菌素对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌及白假丝酵母菌均有抑制作用[17-19]。ZHAO 等[20]研究发现植物乳杆菌ZDY2013 的培养上清液与对照组（肉汤培养基）相比能够显著抑制Hp 生长活性。URRUTIA-BACA 等[21]使用罗伊氏乳杆菌ATCC 55730 产生的细菌素Reuterin 与Hp 进行体外共培养实验，发现其对Hp 有明显的生长抑制作用，随着Reuterin 浓度的增加，细菌杀灭时间呈浓度依赖性下降。此外，细菌素Reuterin 显著下调Hp 毒力基因（flaA、vacA和luxS）的表达。这表明细菌素的拮抗作用可能是通过对靶细菌的直接杀灭实现的。细菌素能够破坏Hp 的生物膜，诱导生物膜形态发生改变，在膜上成孔，通过质子动力的耗散以及钾和氨基酸的流出使细菌死亡[22]。目前已发现的能产细菌素的乳杆菌包括植物乳杆菌、加氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等20 余种，产生的细菌素包括Plantaricin、Bactofencin、Gassereccin、Fermencin 和Reutericin 等。另外，细菌素干扰细菌脱氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白质代谢，抑制细菌繁殖，如MccB17 细菌素是DNA 促旋酶抑制剂，分子量<5 kD，它能抑制致病菌DNA 复制，促使细菌发生应急反应；MccC7/C51 细菌素能在tRNA 合成酶上起作用，是蛋白翻译抑制剂，干扰细菌的蛋白质合成过程[23]。不同菌株产生的细菌素存在株间差异，因此需要研究筛选高效稳定拮抗Hp 的细菌素。

此外，乳杆菌释放有机酸（如乳酸、甲酸和乙酸等短链脂肪酸）抑制Hp 生长，研究发现乙酸和乳酸对Hp 的生长抑制作用呈剂量依赖性，其中乳酸的抑制作用更强，不仅能使Hp 产生球型变、抑制分裂繁殖，还能抑制其脲酶活性[24-25]。

2.2 乳杆菌对Hp的黏附抑制作用

Hp 感染的分子机制研究认为，Hp 在胃黏膜表面黏附是其致病过程中的重要一步。体外实验证实，乳杆菌能够抑制Hp 对胃腺癌细胞系AGS 细胞的黏附，这种抑制作用可能与乳杆菌抑制Hp 黏附基因表达、生成黏蛋白和竞争黏附位点有关。为了研究乳杆菌对宿主细胞黏附性的影响，GARCIACASTILLO 等[26]从健康人胃组织中分离到一株乳杆菌（鼠李糖乳杆菌UCO-25A），分别用该乳杆菌预处理AGS 细胞，再用Hp 感染、用该乳杆菌和Hp 在AGS 细胞中共孵育，结果发现乳杆菌预处理和共孵育的AGS 细胞中，Hp 黏附数量较对照组显著减少，这表明乳杆菌具有抑制Hp 黏附AGS 细胞的能力。KLERK 等[27]从28 株乳杆菌中筛选到3 株（加氏乳杆菌Kx 110 A1、加氏乳杆菌Kx 126 A5 和短乳杆菌ATCC 14869）能抑制Hp黏附AGS细胞的菌株，进一步研究发现经具有抑制Hp作用的乳杆菌处理后，Hp 的sabA黏附基因表达下降，故乳杆菌可能是通过下调Hp 相关基因的表达抑制其黏附。另外，ZUO 等[28]构建加氏乳杆菌srtA 突变体，研究黏附功能相关的Sortase 依赖蛋白的作用，结果发现Sortase A 蛋白是影响加氏乳杆菌Kx110A1 菌株表面性质的重要因素，srtA 突变体菌株失去了黏附胃上皮细胞的能力，因此丧失对致病菌的黏附抑制作用，无法防止Hp 定植。

2.3 乳杆菌可能通过改变胃肠道细菌菌群拮抗Hp

LI 等[29]对Hp 相关的萎缩性胃炎、肠化生、胃癌患者及Hp 阴性健康者的胃组织进行菌群研究，发现Hp 感染会导致人胃微生物改变和细菌多样性的减少，Hp 与胃内菌群似乎存在复杂的相互作用关系。某些有益菌（如枯草芽孢杆菌）可以产生保护性的细胞外基质，并与其他益生菌共享，保护益生菌群免受不利环境的影响，这种细胞外基质主要由多糖和其他大分子如蛋白质、酶和脂质等组成[30]。CHEN 等[31]实验发现Hp 感染的小鼠喂食鼠李糖乳杆菌GMNL-74 和嗜酸乳杆菌GMNL-185后，小鼠胃肠道内特定菌群组成发生明显改变，双歧杆菌和嗜黏蛋白-艾克曼菌相对丰度增加，大肠杆菌和梭状芽孢杆菌相对丰度降低，乳杆菌作为益生菌可能通过保护有益生作用的细菌，增加有益菌的丰度进而拮抗Hp 在小鼠胃肠道内定植。PAN 等[32]进行植物乳杆菌ZDY 2013 对胃黏膜炎症和Hp 感染引起的小鼠胃肠道菌群改变的实验研究发现，植物乳杆菌ZDY 2013 能够有效降低致炎细胞因子（白细胞介素1β 和γ-干扰素）表达，使用植物乳杆菌ZDY 2013 预处理Hp 感染的小鼠后，胃肠道内拟杆菌门和厚壁菌门细菌数量增加，表明植物乳杆菌ZDY 2013 在预防胃黏膜炎症和Hp 感染引起的微生物群改变中发挥作用。因此，乳杆菌对菌群的调节作用可能是其抑制Hp 的潜在机制。

2.4 乳杆菌具有炎症抑制作用

Hp 感染胃组织后，分泌细胞毒性相关蛋白（细胞毒素相关蛋白、细胞空泡毒素和热休克蛋白60 等）破环人胃黏膜屏障，使机体产生炎症反应，导致胃组织出现一系列形态学及病理性改变，是胃部疾病发生的重要原因。Hp 对免疫反应的失调会导致促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子、白细胞介 素6 和白细胞介素8 等）异常升高[33]。GEBREMARIAM 等[34]筛选到加氏乳杆菌Kx110A1 可能通过抑制去整合素-金属蛋白酶超家族中ADAM17 表达，影响Hp 感染的巨噬细胞内肿瘤坏死因子和白细胞介素6 的产生。NF-κB 为转录调节因子，能对多种炎症反应进行调节，研究发现鼠李糖乳杆菌GMNL-74 和嗜酸乳杆菌GMNL-185 可抑制NF-κB 介导的炎症活动通路，有效的降低白细胞介素8 的生成，改善Hp 诱导的人胃上皮细胞炎症反应[31]。GARCIA-CASTILLO 等[35]从胃组织中分离出的乳杆菌（发酵乳杆菌UCO-979C）进行体外实验时，发现发酵乳杆菌UCO-979C 明显降低AGS 和THP-1 细胞中炎症细胞因子和趋化因子的产生，增加免疫调节细胞因子的水平，具有显著的抗炎作用。ZHAO 等[20]研究发现植物乳杆菌ZDY2013 能够拮抗Hp 及其体外感染人胃上皮细胞，增强抗炎细胞因子白细胞介素10 的表达，减弱AGS 细胞中促炎细胞因子（肿瘤坏死因子α）的表达。因此，乳杆菌能减轻慢性炎症介导的组织损伤程度，在Hp 感染导致的炎症方面发挥积极作用。

综上所述，从临床研究中较为关注的鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和加氏乳杆菌抑制Hp 分子机制方面进一步发现：三种乳杆菌均能产生细菌素从而发挥对Hp 直接杀菌作用；细胞实验发现，鼠李糖乳杆菌和加氏乳杆菌具有明确抑制Hp 黏附的作用；体内动物实验表明，鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌能够通过改变小鼠菌群抑制Hp 在小鼠体内定植；此外，三种乳杆菌均能抑制Hp 感染介导的炎症因子表达，减轻慢性炎症介导的组织损伤程度。因此鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌和加氏乳杆菌均能够抑制Hp 感染。根据前期文献报道，仍有10%～15%患者通过乳杆菌联合抗生素治疗，Hp根除失败。因此，筛选更高效的乳杆菌菌株进一步提升Hp 疗效将是未来的研究重点。

3 展望

目前用于临床研究中的乳杆菌大多源自粪便、发酵产品或肠道等，菌株分离位置的不同导致菌株间抗菌特性的差异，可能是临床疗效不同的原因之一。据研究报道，至今已从胃内分离出包括嗜酸乳杆菌、厄尔纳拉乳杆菌、胃窦乳杆菌、加氏乳杆菌、发酵乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、阴道乳杆菌、唾液乳杆菌、粘膜乳杆菌、卷曲乳杆菌、口乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌等乳杆菌[36-38]。胃内定植的乳杆菌菌株长期适应胃内环境，相对于其他来源的菌株是否具有更加高效抗Hp 作用，需要在未来的研究中重点关注。

近年，纳米材料作为高效载体在生物医学应用方面表现出巨大潜力。研究发现当由乳铁蛋白修饰的仿生羟基磷灰石纳米颗粒与副干酪乳杆菌的无细胞上清液结合时，对Hp 的抗菌活性较单独或合用乳铁蛋白、副干酪乳杆菌的效果更强[39]，表明纳米材料使乳杆菌的抗菌作用增强。另外，ZHANG 等[40]研究发现乳杆菌产生的细菌素与纳米材料结合后可以更好地附着在Hp 感染的小鼠胃黏膜上，进而更有效地清除Hp。因此，乳杆菌产生的细菌素与纳米材料有效结合，研发新型抗Hp 制剂，或能替代抗生素，将是提升Hp 根除率的新途径。