γδT细胞对肿瘤发生、发展的影响及其在肿瘤免疫治疗中的应用①

刘玉霞 张彩（山东大学药学院免疫药物学研究所，济南250012）

γδT细胞是一群性质独特的固有免疫细胞，主要分布于皮肤、黏膜等部位，参与多种免疫应答和免疫调节的过程，如介导免疫炎症反应、直接识别并杀伤肿瘤等［1］。γδT细胞识别抗原无MHC限制性，能够迅速地对多种入侵的病原体产生免疫应答，被称为是抵抗外来感染的第一道防线。γδT细胞不仅在抵抗外来感染中发挥着重要的作用，在肿瘤免疫中也发挥着重要的作用。研究发现γδT细胞对多种肿瘤如乳腺癌、结肠癌、肺癌具有积极的抗肿瘤作用，可以通过其强大的细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，也可以间接的通过影响其他免疫细胞的功能发挥抗肿瘤作用，如增强树突状细胞呈递抗原的能力、增强细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力等［2］。然而，也有研究表明γδT细胞具有促肿瘤作用。如分泌IL-17的γδT细胞亚群，即γδT17细胞，是肿瘤微环境中IL-17的主要来源。IL-17可以通过促进非小细胞性肺癌、胃癌、胆囊癌等肿瘤组织的血管生成促进肿瘤的发展。γδT17细胞还能招募MDSC（骨髓来源的抑制细胞）到肿瘤部位，抑制免疫细胞杀伤肿瘤的功能进而促进肿瘤的生长［3］。

由此可见，γδT细胞作为机体免疫防御的第一道防线，在抗肿瘤作用中发挥着重要的作用［4］。但是，肿瘤微环境的长期影响会调控γδT细胞的功能，使γδT细胞转变为促进肿瘤进展的细胞亚群，如γδT17细胞亚群、调节性γδT细胞（γδ Treg）亚群等。本文就γδT细胞及其主要亚群、γδT细胞识别肿瘤及其杀伤肿瘤的机制、γδT细胞促进肿瘤发生、发展的机制以及γδT细胞在免疫治疗中的作用等方面做一综述。

1 γδT细胞亚群的分类

目前对于γδT细胞亚群的分类主要有3种方法。①根据TCRγ或δ的组成进行分类。通常人的γδT细胞根据TCRδ的组成不同分为三大亚群，即Vδ1+、Vδ2+、Vδ3+γδT细胞，各个亚群的分布和特点不完全相同［5］。Vδ1+γδT细胞主要分布于皮肤、小肠等黏膜组织，在脾脏、肝脏中也有发现，Vδ1+能够和多种Vγ链（如Vγ2、Vγ3、Vγ5和Vγ8等）共表达，组成不同的γδT细胞亚群。Vδ1+γδT细胞对慢性淋巴系白血病细胞具有特异性的细胞毒性［6］。Vδ2+γδT主要存在于外周血中，是参与血液循环的主要γδT细胞，在TCRγδ重排过程中，Vδ2几乎只和Vγ9共表达，Vγ9Vδ2γδT细胞能够识别磷酸化抗原，具有很强的抗肿瘤能力，能够抑制肿瘤细胞的增殖并促进肿瘤细胞的凋亡［7］。Vδ3+γδT细胞主要存在于肝脏和小肠上皮，目前关于其对肿瘤进程影响的研究还很少［8］。而小鼠γδT细胞则通常根据TCRγ链进行分类，可分为6个亚群，通常采用“Heilig命名法则”对其命名，分别是Vγ1+、Vγ2+、Vγ4+、Vγ5+、Vγ6+与Vγ7+γδT细胞亚群［9］。②根据γδT细胞表型进行分类。目前有许多表面标记可以用于γδT细胞亚群的分类，如CD27、CD44、Ly-6C等。目前最公认的标志是CD27，根据CD27的表达可以将小鼠γδT细胞分为CD27+γδT细胞和CD27-γδT细胞，这两群细胞分泌的细胞因子不同，通常认为CD27+γδT细胞主要分泌IFN-γ，而CD27-γδT细胞主要分泌IL-17。此外，还可以根据CD27和CD45RA的表达，将其分为4个亚群，即幼稚型（CD27+CD45RA+）、效应记忆型（CD27-CD45RA-）、中央记忆性（CD27+CD45RA-）和终末分化型（CD27-CD45RA+）γδT细胞［10］。③根据γδT细胞的功能进行分类。与αβT细胞类似，γδT细胞也可以根据功能的不同分为不同的亚群，如γδT1、γδ T17、滤泡辅助性γδT（γδTfh）、调节性γδT（γδTreg）与记忆性γδT（memory γδT）细胞等［11］。γδT1细胞是指分泌IFN-γ的γδT细胞，γδT17则是指分泌IL-17的γδT细胞。γδTfh细胞与传统的Tfh细胞的功能类似，能够促进B细胞的成熟和产生抗体的能力［12］。γδTreg细胞能够表达一种特异性的转录因子FOXP3，具有免疫抑制功能［13］。Memory γδT细胞具有免疫记忆的特点，在再次接受同一抗原刺激后能够迅速产生免疫反应［14］。

2 γδT细胞抗肿瘤作用的机制

2.1 γδT细胞识别肿瘤细胞的机制识别肿瘤细胞是γδT细胞能够杀伤肿瘤的基础。γδT细胞识别肿瘤抗原主要通过TCR依赖和NKR依赖的两种方式［15］。Vγ9Vδ2γδT细胞主要通过TCR依赖的方式识别肿瘤相关抗原，最早发现的是Vγ9Vδ2γδT细胞能够通过TCR依赖的方式特异性地识别非肽类的磷酸化抗原，如异戊烯焦磷酸（IPP）［16］。在正常组织内，细胞会经甲羟戊酸代谢途径合成类异戊二烯（isoprenoid）参与胆固醇的合成，在此过程中也会生成少量的IPP。而在肿瘤组织中为了满足肿瘤的能量供应，甲羟戊酸代谢途径增强，会导致IPP在细胞内的累积超出正常生理范围，从而被Vγ9Vδ2γδT细胞识别并杀伤［17］。F1-ATP酶一般在线粒体膜上表达，偶尔在肝细胞和肿瘤细胞上也能表达，Vγ9Vδ 2γδT细胞能被异常表达在肿瘤细胞表面的Fl-ATP酶激活，在载脂蛋白A-1（apoA-1）的参与下还能强化此激活作用，其机制在于F1-ATP酶能够与apoA-1形成复合物递呈磷酸化抗原使其被Vγ9+Vδ2+TCR识别［18］。最近有研究表明，Vγ9Vδ2γδT细胞识别磷酸化抗原依赖于嗜乳脂蛋白3A1（BTN3A1，也称为CD277），BTN3A1是B7超蛋白家族的成员，在Vγ 9+Vδ2+TCR识别磷酸化抗原中发挥着重要的作用，然而BTN3A1与磷酸化抗原之间相互作用的分子机制还需进一步研究［19］。内皮细胞蛋白C受体（EPCR）是近些年来新发现的γδTCR的配体，是C蛋白通路的重要组成部分，属于MHCⅠ/CD1类蛋白分子，在缺氧和炎症状态下保护内皮屏障。EPCR仅在内皮细胞上表达，内皮细胞是CMV感染的主要靶点，在CMV感染的上皮细胞和上皮肿瘤细胞EPCR表达会上调，γδTCR与EPCR的相互作用使得γδT细胞能够识别CMV感染的上皮细胞和上皮肿瘤细胞［20］。

γδT细胞除了通过γδTCR识别肿瘤抗原外，还可以通过自然杀伤细胞受体（NKR，如NKG2D、DNAM-1、NKp30、NKp44和NKp46等）识别表达在肿瘤细胞上的相应的配体识别肿瘤细胞［21］。NKR在NK细胞中能够调节NK细胞的活化和功能，在γδT细胞中发挥着免疫监视的作用，能够区分转化的细胞以及感染的细胞。NKG2D是一种C型凝集素受体，其配体在大多正常组织上不表达而在肿瘤细胞上高表达，γδT细胞可以通过NKG2D识别其配体对肿瘤细胞行使其杀伤作用。目前在人类细胞中发现的NKG2D的配体包括MHCⅠ类分子相关蛋白（MICA/MICB）和6种ULBP结合蛋白（ULBP1-6）［22］。之前一直认为NCR是NK细胞特有的，然而近些年在活化的小肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes，IELs）和固有样淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILCs）中均发现了NCR的表达［23］。尽管γδT细胞在正常情况下不表达NCR，但在TCR激动剂持续的刺激以及IL-15或IL-2的诱导下大部分γδT细胞能够表达NCR，并且这一现象基本上只在Vδ1+γδT细胞上出现，Vδ2+γδT细胞尚未发现此现象［24］。Vδ1+γδT细 胞 诱 导 产 生 的NCR主 要 有NKp44、NKp30、NKp46，这些NCR+Vδ1+γδT细胞具有更强的对肿瘤细胞的靶向杀伤能力和分泌IFN-γ的能力［21，25］。基于这些研究，已经有人开发出了新型细胞产品NCR+Vδ1+γδT细胞用于肿瘤过继免疫治疗，并且能够有效控制慢性淋巴细胞白血病的生长和扩散［26］。

2.2 γδT细胞抗肿瘤机制γδT细胞可以通过多种途径发挥直接的抗肿瘤作用：如通过释放穿孔素-颗粒酶裂解肿瘤细胞或Fas-FasL和TRAIL途径诱导肿瘤细胞的凋亡，还可以通过ADCC途径以及分泌细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）杀伤肿瘤细胞［5］。

γδT细胞还可以通过影响B细胞、αβT细胞、树突状细胞（DC细胞）、NK细胞等其他免疫细胞的功能间接发挥抗肿瘤作用。有文献指出当Vγ9Vδ2T细胞和IPP、IL-21在体外共孵育时，Vγ9Vδ2T细胞会显示出滤泡辅助性T（Tfh）细胞的特点，提高B细胞分泌抗体的能力［27］。γδT细胞还可以作为αβT细胞的抗原递呈细胞，参与αβT细胞的活化过程，使naïve αβT细胞分化为效应T细胞，发挥抗肿瘤作用。当受到肿瘤抗原刺激时，γδT细胞会上调抗原递呈分子HLA-DA、共刺激和黏附分子（CD80、CD86和CD40等）的表达，γδT细胞还会上调清道夫受体CD36的表达，参与肿瘤细胞碎片的清除，此时γδT细胞会发挥其抗原递呈细胞的功能引起抗原特异性CD8+T细胞的应答［28］。γδT细胞还可以促进DC细胞的成熟，反过来，DC细胞也能诱导γδT细胞的活化和增殖。有研究表明DC细胞的成熟依赖于TNF-α和细胞之间的相互接触，γδT细胞分泌的TNF-α、γδT细胞与DC细胞的相互接触促进了DC细胞的成熟，这两者的交互作用能够加强γδT细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤作用［29］。

3 γδT细胞促进肿瘤发展的机制

虽然γδT细胞能够通过直接杀伤肿瘤细胞、分泌细胞因子（IFN-γ、TNF-α等）、促进DC细胞成熟等方式发挥抗肿瘤作用，但这一功能往往会被肿瘤微环境所抑制，肿瘤微环境甚至会促使γδT细胞转变为促进肿瘤进展的亚群。

目前我们所知的γδT细胞的促肿瘤能力主要来源于其分泌的IL-17。IL-17是一种促炎因子，能够促进慢性组织炎症的发展进而促进肿瘤的进展。在多种恶性肿瘤（如胰腺癌、肝癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等）中均发现IL-17水平升高与肿瘤的转移和不良预后有关［30］。分泌IL-17的γδT（γδT17）细胞在健康个体中很少发现，但在一些疾病环境（如脑膜炎和癌症）中则会发现γδT17细胞的聚积。有文献证实，结直肠癌病人肿瘤部位上皮屏障的破坏会引起微生物产物和炎性树突状细胞的聚积，促使γδT细胞向γδT17细胞极化［31］。激活的炎症树突状细胞会诱导γδT17细胞分泌IL-17、IL-8、TNF-α、粒细胞集落刺激因子等。IL-17进一步促进肿瘤部位血管增生、募集免疫抑制性MDSCs到肿瘤部位发挥促肿瘤作用［3，32］。肺是一种黏膜组织，定植着多共生菌，JIN等［33］发现当肺癌发生时肺部的总菌群载量增加但菌群多样性减少，肿瘤部位菌群的失调刺激组织驻留的γδT细胞活化，使之分泌大量的IL-17和其他促炎介质，进而促进中性粒细胞浸润和肿瘤细胞增殖，这进一步加剧炎症和菌群失调，加速肿瘤进展的恶性循环。

有研究者证实γδT细胞在γδTCR单抗和TGF-β的刺激下会转变为FOXP3+γδTreg细胞［34］。γδTreg细胞和传统Treg细胞的功能类似，能够分泌多种抑制性细胞因子，如IL-10和TGF-β，抑制αβT细胞对肿瘤的免疫应答。肿瘤微环境中存在着大量的免疫抑制分子，是否会影响γδT细胞对肿瘤的作用呢？研究发现，肿瘤浸润的γδT细胞往往会发生表型或（和）功能的改变。在胰腺癌病人中发现γδT细胞广泛分布于肿瘤间质中，而在正常胰腺中则无分布，并且肿瘤浸润的γδT细胞具有独特的表型，高表达趋化因子受体CCR2、CCR5和CCR6，提示肿瘤微环境中可能存在多种趋化因子趋化γδT细胞向肿瘤部位浸润。胰腺癌微环境中的γδT细胞高表达FOXP3和程序性死亡受体-配体PD-L1，抑制αβT细胞的增殖和活化，使肿瘤部位的αβT处于免疫抑制或功能耗竭状态［35］。

由此可见，肿瘤微环境能够募集大量的γδT细胞向肿瘤部位浸润，并改变它们的表型和功能，肿瘤浸润的γδT细胞进而又能加剧炎症、促进血管增生、招募MDSCs等抑制性细胞，进一步促进肿瘤的进展。因此，若能纠正肿瘤微环境，逆转肿瘤浸润的γδT细胞的负调作用，对于γδT细胞用于肿瘤免疫治疗将有重要意义。

4 基于γδT细胞的肿瘤免疫治疗

肿瘤免疫治疗通过重新启动或增强肿瘤病人的抗肿瘤免疫反应，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤。目前基于αβT细胞的肿瘤免疫治疗已经取得了一定进展，但治疗的持久性和有效性还需进一步改进。这是由于αβT细胞的活化依赖于特定肿瘤相关抗原（TAA）、MHC分子以及共刺激信号。一旦TAA、MHC分子或共刺激信号丢失，αβT细胞对肿瘤的杀伤能力就会降低甚至导致αβT细胞的失能［36］。

由于γδT细胞自身识别肿瘤抗原无MHC限制性，且对肿瘤细胞具有较强的细胞毒作用，并且在体外、体内均能大量扩增，γδT细胞在肿瘤免疫治疗中有巨大的应用前景。然而，由于γδT细胞自身对肿瘤的发展具有双重作用，为了保证γδT细胞在肿瘤免疫治疗中发挥积极的抗肿瘤作用而不是促肿瘤作用，往往不会直接使用未经处理的γδT细胞进行肿瘤免疫治疗，而是使用经特异性扩增、具有特定亚型的γδT细胞进行治疗，目前研究最多、最具应用前景的是Vγ9Vδ2γδT细胞和Vδ1γδT细胞。

Vγ9Vδ2γδT细胞主要存在于人外周血中，占外周血γδT细胞的50%～70%，能够识别磷酸化抗原并被其活化。已经有研究证实将分选得到的γδT细胞在氨基二碳酸盐类药物（N-BPs类药物，如唑来膦酸）和IL-2或的刺激下能够激活Vγ9Vδ2γδT细胞并实现Vγ9Vδ2γδT细胞的特异性扩增。使用体外扩增的Vγ9Vδ2γδT细胞进行过继转输治疗时，往往也会伴随使用唑来膦酸和IL-2以维持Vγ9Vδ2γδT细胞的活化状态，并增加肿瘤细胞对Vγ9Vδ2γδT细胞的杀伤敏感性［37］。转输Vγ9Vδ2γδT用于肿瘤免疫治疗已在多种晚期实体瘤的临床试验中初步显示出较好的安全性与疗效。ALNAGGAR等［38］发现将Vγ9Vδ2γδT细胞与唑来膦酸在体外培养扩增后过继转输给Ⅳ期胆囊癌的病人给予治疗，治疗8个疗程（前6个疗程是每2周1个疗程，后2个疗程是每4周1个疗程，每个疗程治疗3次，每次输注4×108个Vγ9Vδ2γδT细胞）后发现肿瘤的体积减小，病人的生活质量提高，淋巴结明显缩小，未见明显的副作用。研究者还发现Vγ9Vδ2γδT细胞治疗后功能性CD4+T细胞和CD8+T细胞比例有所升高，而耗竭的CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例降低［38］。

Vδ1γδT细胞是一个近些年被广泛关注的具有较强抗肿瘤活性的亚群，能够被多种配体激活，如应激反应产生的自身抗原，CD1c/d递呈的糖脂抗原以及多种潜在的未发现的配体［39］。Vδ1γδT细胞具有很强的抗肿瘤活性，与Vγ9Vδ2γδT细胞相比，Vδ 1γδT细胞的活化不依赖于N-BPs类药物，并且能在体内长时间参与循环，有望维持长期的治疗效果。虽然Vδ1γδT细胞的比例在外周血的比例不高，但目前人们已经开发出成熟的在体外扩增Vδ1γδT细胞的方法，将分选得到的γδT细胞在TCR激动剂和多种细胞因子（如IL-4、IL-21、IFN-γ和IL-1β）的刺激下3周内能够将Vδ1γδT细胞扩增至1 000倍，并且能够将初始比例小于0.5%的Vδ1γδT的比例提高至超过70%［26］。Vδ1γδT细胞对急性髓系白血病等多种淋巴系和髓系血液瘤具有较好的治疗效果，过继转输Vδ1γδT细胞治疗能够降低患者血液和靶器官中的肿瘤负荷，显著延长患者的存活时间，且无明显毒性［40］。

近些年，CAR-T细胞在治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤方面取得了极大的进展，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。然而，CAR-T细胞免疫疗法在临床应用中还存在着细胞因子风暴、脱靶效应、对实体瘤效果不佳以及治疗后复发率高等问题［41］。由于γδT细胞独特的识别肿瘤的能力，人们开始思考CAR-γδT细胞是否能够成为另一个有巨大潜力的用于肿瘤过继细胞免疫治疗的效应细胞［42］。DENIGER等［43］曾构建出靶向CD19的CARγδT细胞，发现CAR-γδT细胞在体内、体外对CD19+的肿瘤细胞的细胞毒性均有明显的提高，说明CARγδT细胞有望用于治疗肿瘤。GD2是一种神经节苷脂，广泛表达于神经母细胞瘤细胞表面和其他几种癌症类型上，为了限制CAR-γδT细胞的毒副作用，FISHER等［44］将Vγ9Vδ2+T细胞进行结构改造设计了一个靶向GD2的CAR-γδT细胞。此设计中，CAR-γδT细胞的激活需要两个相互独立的信号，γδTCR识别肿瘤抗原为第一信号，抗GD2的单抗识别GD2并激活下游的共刺激信号域提供第二信号，在这两个信号的同时参与下CAR-γδT细胞才能被活化发挥抗肿瘤作用。由于正常的细胞不会被Vγ 9Vδ2+T细胞杀伤所以经修饰的靶向GD2的CARγδT细胞不会对正常组织产生毒性。CAPSOMIDIS［45］也表明他们构建出的靶向GD2的CAR-γδT细胞能够维持向肿瘤部位的迁移能力和对肿瘤细胞特异性的细胞毒性。靶向CD19的CAR-γδT细胞用于治疗淋巴瘤和白血病的临床研究也正在开展，CAR-γδT细胞有望在将来成为一种新型的肿瘤免疫治疗方式。

5 总结与展望

γδT细胞对肿瘤的影响及其用于肿瘤免疫治疗的巨大潜力逐渐引起了人们的关注。由于γδT细胞识别肿瘤抗原无MHC限制性，γδT细胞用于肿瘤免疫治疗也许能够避免因MHCⅠ类分子下调而导致的免疫逃逸，同时也能够避免免疫排斥反应，尤其适用于同种异体的过继转输策略，在未来有望制备出现成的同种异体的细胞治疗产品［46］。然而，γδT细胞用于肿瘤免疫治疗仍然存在一些问题，如治疗的反应率低以及如何保证γδT细胞发挥抗肿瘤作用而不是促肿瘤作用。为了解决这些问题，将对肿瘤具有特异性杀伤作用的γδT细胞纯化出来或制备工程化的γδT细胞（如CAR-γδT细胞）用于肿瘤免疫治疗将会提高γδT细胞治疗的反应率并具有更好的治疗效果。肿瘤微环境对γδT细胞的功能影响较大，如何纠正肿瘤微环境，逆转γδT细胞的促肿瘤作用也是在未来的研究中我们应该关注的问题。分泌IFN-γ和IL-17的γδT细胞亚群之间的平衡对于治疗的效果有较大的影响，在未来的临床试验中应该关注这一点，研究发现IL-23和TGF-β对于分泌IL-17的细胞的分化是至关重要的，可考虑使用抗IL-23或TGF-β的单克隆抗体阻止γδT细胞向γδT17细胞分化［47］。另一个需要关注的重要因素是微生物菌群的影响，目前已经有文献报道了肿瘤部位的共生菌群通过影响γδT细胞进而影响肿瘤的进展，可以考虑联合抗生素治疗清除不利的菌群［33］。在未来的研究中，仍需继续探索如何提高γδT细胞治疗的效果以及如何逆转肿瘤微环境对γδT细胞的影响，若解决了这些问题，γδT细胞免疫治疗有望成为一种有巨大应用前景的新型肿瘤免疫疗法。