抗体模拟物及多肽的研究进展及应用前景①

谭小艳 李翀 顾大勇 何建安 龙军（南方医科大学珠江医院检验医学科，广州510280）

抗体是一类重要的生物药物，由于它们与抗原的高亲和力和特异性的相互作用及单克隆抗体技术的不断发展，在临床治疗和诊断方面起着举足轻重的作用，但也存在许多局限性，如药代动力学不足、组织可及性差、免疫原性不良和生产成本高，且抗体分子量大，穿透性差，限制了其广泛使用。目前，针对目标抗原的合成多肽及多肽的模拟物是抗体的重要替代品，如来源于互补决定区（complementarity determining region，CDR）的某些小分子多肽可以替代其源抗体，发挥与完整抗体相同的生物功能和特异性结合［1-2］。抗体模拟技术是在20世纪90年代才发展起来的一种新兴技术，有文献称，CDR区的几个关键氨基酸序列在抗体与抗原的界面相互作用及特异性结合之间占据着重要地位，尤其是免疫球蛋白重链互补决定区3（HCDR3）区，基因的连接、组合和重排机制，成为人类抗体库广泛多样性的原因［3］。因此如果将该结合部位的氨基酸残基分离出来，并通过计算机模拟及化学合成的方式维持其在结合位点上的空间构象，尤其是CDR区的转角构型，在维持抗体的功能和特异性方面起着非常重要的作用，理论上能够得到与抗原特异性结合的小分子抗体模拟物［4］。

1 抗体的结构及其与抗原结合的特点

抗体是免疫系统受刺激后产生的一种蛋白质，其作用是靶向中和病原体和毒素。抗体呈Y字型的四聚体结构，含两条相同的重链和两条轻链。Y字的顶端由重链和轻链可变区组成，在可变区有小部分氨基酸变化特别强烈且其残基和排列顺序等易发生变异，该位置被称为高变区，也即CDR区［5-6］。另外，抗体可经木瓜蛋白酶水解成一个结晶片段（Fc片段）和两个抗原结合片段（Fab片段），抗体的主要治疗是基于抗蛋白质的抗体阻断蛋白质的配体结合位点来抑制疾病相关的蛋白质——配体相互作用，该作用由抗体的可变区（Fv）介导。另一方面，抗体的细胞毒性作用与其Fc结构域相关，其通过与自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和树突细胞上的Fc受体，以及补体蛋白的相互作用诱导靶细胞裂解［7-8］。

不同抗体CDR区的氨基酸残基种类、数量和氨基酸序列各不相同。由于抗体具有多样性的巨大潜力，HCDR3被认为是抗体分子在赋予结合活性和特异性方面最重要的成分，尤其是HCDR3空间构象（如β-转角、环状结构等）的多样性与抗体的多样性密切相关。因此，HCDR3成为独特的标识符，用于研究体内适应性免疫应答。如齐静等［9］以抗P-糖蛋白单克隆抗体（PMHA02）为模板，通过单链抗体三维结构的方式，在该抗体的HCDR3区β转角插入半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及芳香族氨基酸修饰的环肽（据报道，其可以增加抗原与抗体结合的稳定性，并维持CDR样转角构型［10］），由此设计了抗P-糖蛋白抗体的十四环肽模拟物，并证实该抗P-糖蛋白抗体肽模拟物可以与PMHA02抗体竞争结合K562/A02细胞，也就是说该模拟物对P-糖蛋白具有相同结合活性。

2 小分子抗体模拟物及多肽的应用

2.1 CDR来源性多肽以多肽、蛋白质类治疗剂为先导物，利用化学合成的方法合成蛋白质多肽类治疗剂的非肽小分子模拟物可解决蛋白质、多肽类治疗剂存在的缺点。这种小分子模拟物保持先导物药效基团的有效空间排布及其功能构象，因此具有与先导物相同的生物功能［11-13］。有大量证据表明HCDR3是抗体结合特异性的主要决定因素，如：从合成抗体文库中选择特异性抗体，其多样性仅限于HCDR3。有文献称，仅相同的文库与LCDR3多样性组合时，从含有HCDR3多样性的合成文库中能选择更多数量的抗体，进一步证实了HCDR3在抗体多样性方面的重要性［14-15］。PERSSON等［16］在重链（CDRH3）和轻链（CDR-L3）的第三互补决定区中构建了具有相同化学多样性的合成噬菌体展示抗体库，由于产生抗体编码基因的遗传机制，CDR-H3比CDRL3更加多样化。更令人惊讶的是，合成的组库产生了许多功能性抗体，这些功能性抗体都具有固定的CDR-H3序列。另外，在识别10种不同抗原的丙氨酸扫描分析中发现，含有共同且固定的CDR-H3环的抗体序列能够有力地促进抗原识别。以上结果与从天然抗体分析得到的抗原识别观点形成对比，该学者推测在抗原识别的过程中，抗体的CDR-H3环起主要作用，而CDR-L3起辅助作用。

除展示文库外，具有限于HCDR3的抗体多样性的转基因小鼠能够在体内产生高亲和力反应［5］。进一步的证据表明，HCDR3是抗体结合特异性的主要决定因素，这是由于从HCDR3结构中提取的肽可以表现出抗体的生物活性，甚至有案例表明这种提取的多肽能达到治疗性抗体的作用，如TIMMERMAN等［17］利用CDR区构建抗胃泌素G17的多肽药物，众所周知，胃泌素肽是调节胃酸分泌的激素，并且可以作为胰腺癌、胃癌和结肠、直肠癌的生长因子。胃 泌 素17（pyroEGPWLEEEEEAYGWMDF-NH2，G17）是最具生物活性的形式之一，这使得它成为开发治疗性抗体的一个有趣的靶点。因此该研究团队通过用苯环结构的基质平台将轻链及重链可变区的几段序列互配，合成双环肽、单环肽、三环肽等结构，利用此结构开发了相关性好的抗胃泌素结合物。其中含CDR3区的双环肽经ELISA实验验证具有较高的OD值，三环肽经表面等离子共振体（surface plasmon resonator，SPR，利用光学折射的原理检测生物传感芯片上配体与分析物之间相互作用的情况）检测反应强度最高。

因为在大多数情况下，天然来源的CDR3肽表现出很低的活性和亲和力，因此需要对其序列进行分析以解决多肽缺乏抗体结构域问题。在QIU等［18］的研究中，通过筛选溶菌酶免疫的噬菌体展示VHH文库，在侧翼鉴定了具有框架3（FR3）和FR4的CDR3结构域抗体。该抗体具有有效的酶抑制活性和高热稳定性。通过序列比对和定点诱变分析，发现FR3中氨基酸位置为88处的半胱氨酸残基可能在维持CDR3抗体的稳定性中起关键作用。另外，KADAM等［19］利用CR9114和FI6V3这两个可以结合在流感病毒血凝素中间部分的保守位点的广泛中和抗体来合成肽段，因CR9114的作用位点在CDR区及框架区，而FI6V3作用点为CDR区，因此选择CR9114的框架区及FI6V3的CDR区，中间用非蛋白质氨基酸连接后形成肽段，该多肽具有空间构象，应用于检测特异性良好。证实小分子CDR3结构域抗体可以作为亲和力转移的新支架，因此对理解抗原——抗体相互作用有着实质性的指导意义。

2.2 非CDR源性多肽抗体是一类重要的生物药物，但存在局限性，如药代动力学不足，免疫原性不良和生产成本高。针对目标的合成多肽是抗体的重要替代品，然而，肽的设计需要计算工具来指导设计。为了识别特定抗体-抗原（Ab-Ag）界面的相互作用残基，VIART等［20-21］采用了界面相互作用残基（I2R），一种基于分子相互作用计算的选择方法。表位和互补位残基之间所有分子相互作用的聚集使其能够将三维Ab-Ag复合物结构转化为界面图。基于这些数据和分子相互作用的概率，开发了表位-互补位相互作用的多肽设计工具（EPI-Peptide Designer），该工具使用预测的互补位残基作为目标表位以产生靶向肽配体文库。并且使用EPI-Peptide Designer成功预测了301种能够与LiD1靶蛋白（一种在棕色蜘蛛Loxosceles的毒液腺中表达且具有皮肤坏死活性的蛋白质［22-23］）结合的肽（65%能与LiD1结合），比随机产生的肽高出22%的结合率。该工具应该能够开发新一代合成相互作用肽，这些肽在生物传感器，诊断和治疗领域非常有用。

除此之外还有非CDR源性多肽，如噬菌体展示肽文库可通过多种方式在其表面展示不同的肽，①可以利用已知的蛋白质折叠（如锌指折叠、芋螺毒素折叠、免疫球蛋白折叠或胱氨酸结），在这些三级折叠上随机接枝寡肽；②利用巯基反应性化合物或交联剂对其进行化学修饰，在筛选前对显示肽段进行有限的环化和衍生化（如用两个半胱氨酸形成二硫键形成简单的环肽）；③通过改变环大小和氨基酸手性、加入限制性结构单元或者修改某个残基从而在环肽区域引入附着手柄，能够在获得具有重要意义的结合肽的同时，使得其结合亲和力和特异性得 到 进 一 步 改 善［24］。如KHASRAW等［25］通 过 在RGD环肽（RGD可与整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的黏附）上引入受约束的结构单元如N-甲基化氨基酸，从而发现了一种具有序列的头尾环肽——西仑吉肽，其临床研究中表明西仑吉肽在小鼠中具有明显的肿瘤消退作用，同时它还是复发性胶质母细胞瘤患者的潜在单药治疗；MAASS等［26］获得的结合于CTLA-4细胞外结构域的胱氨酸-结肽（CTLA-4为T淋巴细胞表达的抑制性受体）已成为治疗转移性黑素瘤的靶标。胱氨酸结（也称为knottins）是小而紧凑的肽（通常为20～60个氨基酸），由至少3个二硫键的核心组成，它们交织成“结”构象，将含有4个环的环状物与神经曲霉素偶联，融合到抗体Fc结构域或结合蛋白的寡聚结构域，使离解常数在纳米范围内增强。

多肽及其模拟物设计的目标是引入新的生物活性或者以小分子还原剂发挥源抗体的功能作用。NIMROD［27］提出了一种通过关注功能性表位来设计功能性抗体的计算方法，将大规模统计分析与多种结构模型相结合，设计了一种功能性抗体以抵抗细胞因子白细胞介素-17A（interleukin，IL-17A）的促炎作用。基于细胞的分析证实抗体是有功能的，X射线晶体学证实设计的抗体可以结合靶向表位，并且其相互作用由设计的靶点介导。重要的是，这种方法不依赖于设计复杂的高质量3D模型或甚至目标的解决结构。且该方法可用于设计生物活性抗体，消除抗体设计和药物发现中的一些主要障碍。

3 展望

在过去的十年中，批准临床使用的抗体数量急剧增加，利用多肽代替抗体具有制造成本低、免疫原性低、稳定性好、器官/肿瘤穿透力强等优点。事实上，目前许多研究工作都集中利用肽模拟物作为抗体的一种可行的替代靶向治疗，或者是应用于药理学基础研究，在临床诊断应用方面尚缺乏有效的实验证据支持，因此还需要进一步对抗体的结构和功能进行探索，在氨基酸分子水平上继续研究多肽抗体与抗原之间的相互作用，探究抗体的部分氨基酸残基及结构对抗原的结合力产生的影响，并利用该技术合成与源抗体发挥相同作用的高活性多肽抗体模拟物，以期将该模拟物应用于临床诊断。