影响血凝及血凝抑制试验结果的因素

杨 丽

（辽宁省凌海市农业农村发展中心-动物疫病预防控制中心，辽宁 凌海 121200）

血凝和血凝抑制试验是目前县级疫控中心兽医实验室进行禽流感、新城疫动物疫病监测最常用的试验方法之一。但血凝和血凝抑制试验在实际操作中经常受到多种因素的影响，增加了试验误差，甚至改变了试验结果，本文结合实际工作，将影响试验结果的因素进行总结分析。

1 被检样品对试验结果的影响因素

1.1 样品处理 采样后将样品倾斜放置2～4h（防止暴晒），让其自然析出血清(夏天放在室内,冬天可以放置在37℃温箱内析出)。避免摇晃，防止溶血。采血后尽量避免马上离心，防止分离后的血清形成胶冻状或不完全胶冻样。特殊情况需要分离血清时，需1500～2000转/min，离心5min。

1.2 样品保存 采样后要及时送检，不能在24h内送到的，全血要分离出血清，将血清冷冻后送检。分离的血清在冷藏温度下（4℃）存放不能超过5d，冷冻温度下（-20℃）不能存放时间过久（6个月为宜），冷冻后的血清不能反复冻融（不宜超过3次），会直接导致抗体效价降低。血清样品保存不当，无论是运送中还是检验中，腐败变质会严重影响试验结果。

2 鸡红细胞的制备对试验结果的影响因素

2.1 鸡红细胞的采集 实验室应准备3只SPF公鸡，条件不足的也可选免疫过禽流感和新城疫疫苗的的健康公鸡，但应比正常洗涤血球次数增加3～5次，洗去红细胞表面的抗体，以减小结果误差。

给大公鸡采血时要做到无菌操作，用一次性注射器(10mL、9号针头)可在一个大容器内先加入抗凝剂，采血后拔下针头将容器倾斜，沿着容器壁将血缓缓打入，注意速度不要太快，以免挤破红细胞。抗凝剂要适量添加（可以实际经验为准），加入的过多会影响红细胞的结构，抑制凝集现象产生，加入过少则血液出现凝集块，影响试验观察，引起误判使得凝集价偏低，凝集抑制价偏高。同样抗凝剂加入的时间、方法不当同样会产生血凝块，影响检测结果。采血后将采出的3只公鸡血混合再离心，这样配出的红细胞均匀一致。

2.2 1%鸡红细胞的离心配制

红细胞的浓度对血凝及血凝抑制试验的结果有很大影响,采用国家标准规定1%的鸡红细胞。洗涤血球时离心的转速为新城疫2000转/min，禽流感1000转/min，时间为10min，洗涤次数3～5次，不应少于3次，直至上清液与PBS颜色接近为止。如果离心的转速偏高，等体积红细胞数量增大，血凝价测定偏低，血凝抑制价相应偏低；相反离心的转速偏低，等体积红细胞数量减少，结果造成血凝价测定偏高，血凝抑制价相应偏高。离心结束后用吸管将上清液移去（必须除去上层的白膜），切勿倒出去，直接倒出去达不到离心的目的，会使红细胞混入洗液。移完后再用吸管加入等量的洗液，保持离心机的平衡。离心好的红细胞用吸管（最好剪成斜型）小心吸取，不能反复吹吸，以免造成红细胞结构破坏，发生溶血，使用溶血后的血球相当于红细胞的有效浓度降低，会出现上段所述结果，同时影响观察效果。洗涤次数不能减少，以确保得到纯净的鸡红细胞。洗涤次数减少后，血清中的杂质不能洗干净，会干扰反应体系病毒与红细胞的反应，造成试验误差。

配制好的红细胞悬液当日用不完的可置4℃冰箱保存，时间不超过1周，但实际工作中如果每天都使用，超过3d红细胞就开始溶血不能使用，以免影响试验结果。

3 反应板的选择、使用对试验结果的影响

3.1 反应板应选择质量好的一次性96孔V型板，要保持板面及凹孔的干净，板面应水平，不能弯曲、倾斜，使用不合格的反应板会严重影响结果。板孔倾斜的角度会影响红细胞的沉降速度，角度过小，红细胞沉降加快，血凝价偏低，血凝抑制价偏高。角度过大，红细胞沉降减慢，血凝价偏高，血凝抑制价偏低。

3.2 在试验静置过程中不能振动反应板。当反应时间没到而频繁的取放、观察反应板，操作不甚，凝集会受到影响，测定的凝集价偏低，而凝集抑制价会偏高。因此在静置过程中一定要轻拿轻放，最好是等到时间再看结果，才能保证实验的准确性。

4 抗原效价的测定及配置对试验结果的影响

4.1 抗原的保存 血凝及血凝抑制试验用的抗原一般是干粉，应-20℃保存。在进行抗原效价的测定时，同一批号的抗原最好同时使用，并要经过4HAU抗原回滴，对抗原进行最终校正，重复试验，减少误差。抗原的凝集价在外界不稳定，冷藏保存或反复冻融时其血凝价降低。测定好血凝价的抗原如果一次不能用完时应分装到灭菌离心管内，管上标注分装日期和效价，每管的分装量最好是一次使用量，避免反复冻融。使用反复冻融的抗原，血凝抑制滴度会偏高，一般血凝价相差的滴度与血凝抑制价相差的滴度相一致。

4.2 稀释液

稀释液应使用pH为7.0～7.2的PBS缓冲液，pH值7.2时，红细胞沉降最充分，图形最清晰；PBS液的pH在5.8以下,红细胞易自凝，试验结果不成立；pH7.8以上凝集的红细胞洗脱加快，易造成观察误差，使得凝集价检测偏低，凝集抑制价偏高。PBS液要现配现用，PBS要在高压后调至pH7.2。如果用生理盐水代替PBS液，要使用新开瓶的灭菌生理盐水，稀释液的配制时间不宜过长，一经使用保存不要超过3周，否则可能被环境污染，不能保持无菌的反应环境，使得检测结果受到干扰，出现试验不成立、跳孔等现象。

4.3 4单位病毒液的配制使用 计算好本次试验所需要的病毒液量，配制的4U病毒液量应适当正好，避免浪费和不够，配制好的病毒液要混匀，混合不均时，病毒的含量不一，浓度高的血凝抑制价降低，浓度低的血凝抑制价升高。病毒液要现配现用，放置时间不应超过6h，并置于4℃冰箱保存。加样时从冰箱取出。时间过长，病毒的凝集力降低，不放冰箱保存，病毒的凝集力会很快下降，不能继续使用。加入4U病毒抗原时应该从稀释倍数高的孔向稀释倍数低的孔加入（即从后向前加），滴加过程中采取悬滴法，避免移液吸头接触液面而被反应板中的液体污染。振荡的时间一般不少于1min，时间过短不能充分混合，凝集抑制价升高，时间过长血球容易被破坏，结果失败，阴、阳对照不能成立。

5 加样过程对试验结果的影响

5.1 血清样品 病毒悬液和红细胞悬液在使用前一定要摇匀，以保证每一孔中加入的浓度准确一致，避免加入的浓度高低不一，人为造成误差。摇晃红细胞悬液时力度不宜过大，防止红细胞的结构被破坏，造成溶血。

5.2 在使用微量移液器时，吸头要安装牢固，防止漏气，操作时移液吸头应插到液面以下（要求悬滴的除外），手压下的力度要均匀，否则移液量不准，造成结果偏差。在使用多道移液器时，吸取液体后观察几个吸头中液面是否水平一致，有时操作不注意可能某个吸头吸入量或多或少，直接影响结果测定。吸取的过程应该做到“慢吸快打”，在吸液时要慢、准，放液时对准后速度要快，可以避免打完后吸头下存留液体，保证加入的液体体积一致。

5.3 加液体时，最好悬滴，避免吸头与反应板孔接触造成污染。尤其是在最后加入红细胞悬液时，孔内已有稀释液、血清、4U抗原等，如果吸头接触到孔内混合液，会造成各个孔内液体相互污染，导致试验结果出现误差。所以在使用移液器时，一定要保持加样器吸头与凝集板孔间的距离，以保证每个凝集孔内液体数量和浓度准确。

5.4 倍比稀释血清时，抽吸6～8次，在吸取第一孔时要先按下移液器，再插入反应板孔内，吸取后插入第二孔液面以下，在反复抽取过程中，移液器吸头不要离开液面，防止产生气泡，造成移液体积不准确。

5.5 滴加1%红细胞悬液时，要经常晃动红细胞悬液（注意不要用移液吸头反复吹打或是搅动，避免破坏红细胞），使红细胞均匀分散在PBS中，防止红细胞下沉，从而影响结果判定。

6 温度和时间对试验结果的影响

环境温度通常应在20～25℃，不能过高或过低，环境温度除了用空调控制外，还可选择将反应板放置于室温温箱内。温度对HI试验值的影响有时较大，室温低于4℃，红细胞会发生自凝。温度高于37℃，凝集的红细胞易洗脱，红细胞很快沉降下来，即出现反应物解离和红细胞溶血现象。低于20℃反应速度减慢，在规定时间观察，对照结果不成立，此时读孔，血凝价易判高，血凝抑制价易判低。所以选择在20℃～25℃完成血凝抑制实验，应通过温箱控温。加入红细胞静置时间应按照操作规程规定的时间及时观察，超时10min以上，红细胞发生裂解，结果不再有意义。

7 4HAU抗原回滴对试验结果的影响

抗原回滴时必须选取奇数排、列的方法，便于取值。方法通常是在微量反应板选择3排5列，第5列为红细胞对照孔。加样后室温(20～25℃)下静置30～40min后观察结果很重要。若第1、2孔凝集,则视为抗原配制正确。若第2孔流淌，则4HAU抗原浓度低，HA效价判高，需添加抗原。若第3孔发生凝集，则4HAU抗原浓度高，HA效价判低，需补加PBS。然后再次回滴，直至第1、2孔凝集,抗原配制正确为止。

8 小结

在血凝和血凝抑制试验中，影响试验结果的因素很多，只有严格按规定操作，细致、耐心地做好每一个环节，发现问题及时纠正处理，才能保证试验结果的准确。