肝星状细胞糖脂蛋白质代谢：抗肝纤维化的新靶标

杨 婷，赵丹雳，周媛媛，王颖谦，李 洋，张 峰，郑仕中

(南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的必经之路，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)在其中扮演重要角色[1]。各种病因(如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等)导致肝脏发生损伤时，静息态的HSC活化并转分化为促进瘢痕形成的肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)并分泌细胞外基质(ECM)促进损伤修复，但过度的ECM累积会导致肝脏纤维化，从而损害正常肝功能，诱发肝硬化，最终导致肝衰竭甚至死亡[1]。与癌细胞增殖过程相似，为满足活化时产生的巨大能量需求，HSC发生了代谢重编程，因此抑制HSC的代谢可能是阻止HSC活化及肝纤维化发生发展的有效方法之一。近年来，越来越多的研究揭示了HSC的代谢重编程机制以及这一过程对肝脏疾病的影响。本文总结了HSC的糖代谢、脂质代谢和蛋白质代谢的最新研究成果，包括HSC活化时发生的Warburg效应、自噬相关的脂滴降解及脂质代谢增加，谷氨酰胺、蛋氨酸等代谢改变等，阐述了HSC活化时三大营养物质的代谢重编程过程及其潜在的应用，为肝纤维化等慢性肝病的治疗提供了新思路。

1 糖代谢

葡萄糖代谢重编程在HSC活化过程中起重要作用，主要通过上调糖酵解以满足活化的能量需求。糖酵解是指在无氧条件下，1分子葡萄糖被分解成为2分子丙酮酸并产生能量，随后生成乳酸的过程。HSC的糖酵解受多种因素影响，如葡萄糖的转运、葡萄糖的细胞内加工、乳酸的生成及一些其他因素如外泌体的分泌和表观遗传修饰等，抑制HSC糖酵解是抗肝纤维化有效策略之一。

葡萄糖的转运是HSC糖代谢过程中ATP产生的限速步骤，葡萄糖转运蛋白(GLUT)承担了葡萄糖的转运工作。研究发现活化的人HSC和培养激活的大鼠HSC葡萄糖利用率均提高[2]，且原代培养激活的大鼠HSC葡萄糖运输能力和糖酵解均增强[3]。在原代培养激活或永生化的大鼠HSC中GLUT1[3]、GLUT2[4]和GLUT4[5]均有表达，并能受细胞外高葡萄糖[3]或嘌呤能信号的调节[5]。有研究发现，天然产物姜黄素能够通过阻断p38 MAPK信号通路阻止GLUT2的膜易位，与此同时刺激过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ的活性和谷胱甘肽的重新合成来抑制GLUT2的表达，进而抑制葡萄糖的运输，产生抗肝纤维化作用[4]。

葡萄糖的细胞内加工是HSC糖酵解的另一关键过程，糖代谢关键酶在这一过程中发挥重要作用。在永生化的人或小鼠原代HSC活化过程中，己糖激酶2(HK2)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和丙酮酸激酶(PK)的蛋白表达均增加[6]。PFKFB3主要功能为催化果糖-2，6-二磷酸的产生，果糖-2，6-二磷酸为关键酶磷酸果糖激酶1(PFK1)的别构激活剂，因此PFKFB3能够间接促进糖酵解的发生。原代小鼠HSC及人HSC-LX2活化过程中，细胞质内多聚腺苷酸化元件结合蛋白4(CEBP4)与PFKFB3 mRNA的3’ UTR结合，催化其poly(A)尾的多聚腺苷酸化进而诱导其翻译，促进糖酵解[6]。这些酶诱导的糖酵解增强还伴随着糖异生相关基因的下调，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)和果糖二磷酸酶1(FBP1)[3]。丙酮酸激酶M2(PKM2)是糖酵解的另一限速酶，活化的HSC(activated HSC，aHSC)PKM2的表达增加，有氧糖酵解水平也随之增加[7]。HSC的活化由二聚化的PKM2介导，天然产物紫草素对肝纤维化小鼠有较好的治疗作用，能够通过促进人HSC PKM2的四聚化来减弱其活性，从而降低胞内葡萄糖消耗和乳酸堆积；与此同时，四聚化的PKM2还通过调控组蛋白修饰直接降低HSC活化相关转录因子的表达，抑制HSC活化[7]。

糖酵解的终产物乳酸与HSC活化和MFB表型的维持有直接关系。aHSC内乳酸输出泵单羧酸转运蛋白4(MCT4)的表达上调，尽管如此，胞内乳酸水平仍然很高；阻断乳酸在胞内的积累可抑制增殖，同时抑制MFB表型相关基因，诱导成脂基因的表达和脂质堆积[3]。抑制乳酸的生成是阻断其在细胞内积累的有效策略之一，乳酸的生成由酸脱氢酶LDH-A催化，研究发现天然产物千层纸素A能通过抑制LDH-A逆转人源HSC-LX2的活化[8]，其机制为通过影响糖酵解阻止细胞骨架形成及肌球轻链蛋白MLC2磷酸化，最终抑制细胞收缩，使MFB表型难以维持[8]。这一结果在体内也得到了验证，千层纸素A治疗降低了肝纤维化小鼠肝脏的高乳酸水平，缓解了肝纤维化[8]。

此外，一些其他因素同样能诱导HSC发生葡萄糖代谢重编程，如外泌体的分泌及表观遗传修饰等。aHSC能够分泌外泌体快速诱导糖酵解，有研究发现，在缺氧和炎症条件下缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)刺激HSC活化，并促进aHSC分泌含有GLUT1和PKM2的外泌体，诱导HSC的糖酵解，进一步促进HSC活化[9]。表观遗传修饰也会导致HSC葡萄糖代谢的改变，在体外培养的人HSC中，促纤维化细胞因子TGF-β1将DNA甲基转移酶DNMT1和组蛋白甲基转移酶G9a募集至染色质，使HSC糖酵解增强[10]。DNMT1和G9a联合抑制剂CM-272能使缺氧和TGF-β1诱导活化的人HSC糖酵解率恢复到静息水平[10]，对体外培养的人肝脏活体切片也无毒性，且有明显抗纤维化作用，有望成为治疗肝纤维化的有效药物[10]。

aHSC中葡萄糖即使在有氧条件下也以糖酵解的代谢方式最终生成乳酸，而不是进入三羧酸循环完全氧化供能，即Warburg效应。葡萄糖的有氧氧化虽有较高的产能效率但其产能速率不及糖酵解，且糖酵解将中心碳代谢成乳酸供机体加工利用而非以CO2的形式完全释放，Warburg效应的存在满足了aHSC分泌ECM、增殖迁移的物质及能量需求。然而，虽然有大量研究证明了HSC活化过程中糖代谢的重要意义，但最新研究发现，静息态的HSC(quiescent HSC，qHSC)与aHSC之间差异表达的代谢基因中只有6%涉及碳水化合物代谢，且尽管aHSC糖酵解基因表达和葡萄糖消耗均增加，剥夺葡萄糖后却并没有抗纤维化作用[11]，表明葡萄糖并不是HSC活化过程中唯一的能源物质。

2 脂质代谢

2.1 自噬与脂滴丢失健康肝脏中qHSC富含脂滴(lipid droplet，LD)，活化时LD丢失。脂肪特异性蛋白27(Fsp27)是LD形成过程中的关键蛋白，Fsp27过表达的原代大鼠HSC活化及增殖均被抑制，其机制可能是Fsp27维持了胞内LD从而使HSC保持在静息状态[12]。HSC活化时LD丢失过程可分为两个阶段[13]。第一阶段，LD被分解成更小的单位，随着细胞的增殖分裂重新分布到新生成的细胞中去。第二阶段，LD逐渐变小；当HSC完全转分化为MFB表型后，LD完全丢失[13]。

HSC活化过程中LD的丢失主要借助自噬来完成。自噬是一种细胞应激反应，参与大分子和细胞器的自溶酶体消化，是营养物质和能量的细胞内来源。自噬关键基因ATG7缺失的小鼠发生肝损伤后，HSC维持其静息状态且胞内LD也未丢失[14]。小檗碱能通过抑制自噬相关基因ATG5从而抑制HSC自噬，促进胞内LD积累，从而抑制人源HSC的活化及增殖，并抑制CCl4诱导的小鼠肝纤维化[15]。有研究者认为LD丢失时胞内视黄醇类物质的减少对HSC活化有重要意义，如脂多糖诱导HSC发生自噬后，胞内LD的丢失引发视黄酸信号功能障碍，进而下调TGF-β伪受体BAMBI，使HSC对TGF-β信号敏感，易于活化[16]；也有研究者持不同意见，认为LD成分水解后游离脂肪酸的释放才是关键，这些释放出来的脂肪酸会进入线粒体进行β氧化，为细胞活化提供“燃料”，如添加内源性油酸可以促进自噬缺陷的HSC活化，而这一现象在抑制脂肪酸β氧化后消失[16]。有趣的是，小鼠缺乏卵磷脂-视黄醇酰基转移酶(LRAT)时，其HSC静息状态下也无LD存在，这种无LD的HSC不能自发活化，但是经诱导后依然可以完全活化[17]。这一结果与在其他模型中观察到的HSC活化伴随着LD丢失相矛盾，可能由于这些LRAT缺乏的HSC活化时利用了脂肪酸以外的其他能源物质。还有研究发现HSC自噬能够通过抑制成纤维性细胞外囊泡的释放减轻肝纤维化[18]，这一观点与先前HSC自噬与活化呈正相关的观点相矛盾，表明HSC自噬是把“双刃剑”，其在肝纤维化中究竟扮演何种角色，未来还需进一步探究。

2.2 成脂基因与脂肪酸代谢qHSC主要功能为储存脂肪，因此也称“肝储脂细胞”，成脂基因维持着qHSC中的脂质稳态。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)和甾醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1c)是两个调控HSC成脂基因转录的主要因子，是HSC处于静息状态的标志，一旦活化就会丢失[19]。异位诱导PPAR-γ和SREBP-1c可以逆转HSC活化[19]，表明成脂转录程序与各种转录因子共同维持着HSC的静息状态。

HSC脂肪酸代谢与HSC活化及肝纤维化的发生发展密切相关。HSC活化过程中脂肪酸的组成发生变化，在HSC活化早期，棕榈酸、油酸、棕榈油酸和硬脂酸这些主要脂肪酸的浓度达到峰值。随着进一步活化，游离脂肪酸总量下降，而花生四烯酸(C20:4)和二十二碳六烯酸(C22:6)相对丰富，脂肪酸伸长酶(Elov15，Elov16)和去饱和酶(SCD1)上调[20]。线粒体内脂肪酸β氧化是HSC活化的重要能量来源，抑制β氧化能够阻止HSC活化[21]，这一作用与抑制自噬产生的作用相类似，这进一步证实了自噬对HSC活化时LD丢失的重要作用[21]。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是一种调节脂肪酸β氧化和脂肪酸从头生成(DNL)的酶，参与HSC活化过程中的代谢重编程。ACC抑制剂通过减少α-SMA的表达和胶原蛋白的产生抑制原代大鼠HSC活化[22]。DNL是HSC活化过程中诱导糖酵解和氧化磷酸化所必需的，ACC抑制剂通过抑制DNL阻止了原代大鼠HSC活化，且对饮食诱导的大鼠肝纤维化有治疗作用，然而DNL调节HSC代谢的分子机制尚不清楚，ACC抑制剂在体内的抗纤维化作用也不完全归因于其对HSC代谢的影响[22]。虽然其作用机制还未发掘完全，但ACC抑制剂已表现了出良好的抗肝纤维化作用，目前已有ACC抑制剂进入临床研究，如firsocostat(GS-0976)。研究发现firsocostat联合应用FXR激动剂cilofexor可通过调控患者肝脏的脂质代谢治疗NASH引起的纤维化和肝硬化，且暂未发现明显毒副作用[23]，具有较好的临床应用前景。

3 蛋白质代谢

活化的HSC中ECM生成有极大的能量需求，这一需求除通过糖和脂肪的代谢重新编程外，还通过蛋白质代谢来满足。有研究认为，细胞增殖过程中，蛋白质代谢可能比糖代谢更为重要，比较qHSC和aHSC之间差异表达的代谢基因发现，涉及碳水化合物代谢的基因仅占6%，而蛋白质代谢相关基因高达38%，其中又以谷氨酰胺代谢的差异最为显著，蛋氨酸代谢也参与其中[11]。

谷氨酰胺分解是HSC活化时除Warburg效应外的另一代谢特征。谷氨酰胺分解过程中，谷氨酰胺首先在谷氨酰胺酶(GLS)催化下脱氨生成谷氨酸，接着转化为α-酮戊二酸，并进入三羧酸循环代谢产能。HSC活化时Hedgehog-YAP信号通路的激活诱导了GLS1的表达以及谷氨酰胺的分解[11]，用通路抑制剂环多巴胺或维替泊芬处理活化的大鼠HSC后，细胞GLS1表达降低，活化水平也随之降低，而这一现象在补充了谷氨酰胺代谢产物α-酮戊二酸后被逆转[11]。在体内，HSC谷氨酰胺的分解标志着肝纤维化的发生，而剥夺谷氨酰胺能有效抑制HSC活化[24]，这种细胞特异性拮抗作用有望成为肝纤维化治疗的新靶点。

蛋氨酸代谢也与HSC活化密切相关，但其作用并不是供能，而是代谢成S-腺苷蛋氨酸(SAM)影响机体的甲基化反应。蛋氨酸是人体正常生长发育所必需的氨基酸之一，饮食中的蛋氨酸在小肠吸收后被用于合成蛋白质或者在蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)催化下生成机体甲基的直接供体SAM。HSC的活化需要两个MAT基因：MAT2A和MAT2B，MAT2B能够激活促纤维化的ERK和PI3K等通路，而MAT2A能够改变胞内SAM的水平，沉默这两种基因能够抑制HSC活化及细胞生长[25]。在HSC活化过程中，MATα2和MATβ蛋白的磷酸化增强，蛋白稳定性增加，有利于人HSC的转分化[26]。瘦素主要由脂肪细胞产生，可通过激活原代小鼠HSC的β-catenin信号通路，减弱E2F-4与MAT2A启动子的结合，从而增加MAT2A的活性[27]，降低患者血浆瘦素水平有望成为治疗肥胖型肝纤维化患者的有效策略之一。目前针对HSC蛋氨酸代谢的研究尚处于起步阶段，其对肝纤维化的影响还需进一步探究。

4 总结与展望

随着研究的深入及“组学”技术(代谢组学、蛋白质组学和表观基因组学)的广泛应用，人们逐渐认识到HSC的异质性，这种异质性表现为拥有不同活化能力，或在再生、纤维化、癌症和免疫调节等方面的作用各不相同的细胞表型，这些不同细胞表型的维持很大程度上借助了代谢调控。迄今为止通过调节HSC代谢治疗NASH纤维化的疗法十分有限，但也有一些已进入临床研究，包括调节葡萄糖、脂质和胆汁酸代谢的FXR激动剂[28]、调节脂质和葡萄糖稳态的甲状腺激素受体β激动剂[29]以及调控脂肪生成的PPAR激动剂[30]等。阐明HSC代谢过程有利于设计治疗肝纤维化的新靶向干预方法，也为其他纤维化疾病的研究提供参考。目前针对HSC代谢的研究大多集中在体外细胞水平，未来仍需在动物体内进一步验证这些研究成果，以期开发出更多可用于治疗肝纤维化的有效药物。