microRNA对缺血性脑卒中血脑屏障影响的研究进展

范晓迪,李 然,李 澎

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室,北京 100091)

缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)具有极高的发病率、致残率和复发率，严重地威胁着人类生命健康。越来越多的证据表明，血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)通透性升高是IS发病过程的关键环节[1]。BBB是存在于大脑血液循环与神经组织之间的特殊屏障结构，它由脑血管内皮细胞、基膜周细胞及星形胶质细胞尾足组成，是维持脑组织内环境稳定、调节脑组织营养与代谢、维持中枢神经系统正常微环境稳态的结构基础[1]。完整的BBB对于大脑功能的维持至关重要，是当今整个医学界瞩目的治疗缺血性脑卒中的关键靶标。

MicroRNA(miRNA)是一类长约20个核苷酸序列的内源表达的非编码短单链RNA，它通过对mRNA的降解或瞬时翻译抑制来负调控靶基因的表达。目前已证明某些特定miRNA是调控IS血脑屏障损伤的重要因子，针对它们进行调控，可能对减少脑缺血引起的BBB损伤和神经血管单元(neurovascular units, NVU)功能障碍，以及改善卒中预后具有重要意义[1-2]。

本文总结了有关miRNA在脑缺血BBB损伤中的作用的最新研究进展，强调miRNA对脑缺血BBB具有极为关键的调节作用；这些最新的研究发现，可以为基于BBB完整性保持的IS治疗策略提供重要的借鉴与参考。

1 miRNA对脑微血管内皮的调节作用

内皮细胞是脑微血管的主要组成部分，生理状态下对维持BBB的完整性和脑微环境稳态起主要作用[2]。脑缺血后脑内皮细胞功能失常导致BBB通透性升高，甚至崩解，从而导致炎症的发生，进一步损伤神经细胞，乃至成倍扩大缺血性脑损伤[1-2]。因此，脑微血管内皮成为抑制IS的重要治疗靶点[3]。miRNA在脑血管内皮中高度表达，并对血管内皮细胞功能具有关键的调节作用[3]。

1.1 miRNA与血管内皮细胞连接复合体BBB内皮细胞交界处的连接复合体由紧密连接(tight junctions，TJs)、黏附连接(adherens junctions，AJs)和缝隙连接(GAP junctions，GJs)组成，连接复合体组件或功能的破坏直接影响BBB通透性。TJs主要包括闭合蛋白(claudins)、咬合蛋白(occludin)、胞质附着蛋白(zonula occludens，ZO)和连接黏附分子(junctional adhesion molecules，JAMs)。AJs主要由钙黏着蛋白(cadherins)和连环素(catenins)组成。在IS中，脑血管内皮TJs往往首先受到影响，miRNA可以通过直接或间接调控TJ蛋白表达，进而影响BBB通透性。

研究证明，miR-155是内皮形态发生的潜在调节剂。在氧葡萄糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)诱导的人原代脑微血管内皮细胞(human primary brain microvascular endothelial cells，HBMECs)损伤中，抑制miR-155，导致claudin-1和ZO-1蛋白表达升高，而将claudin-1 cDNA转染到OGD损伤的HBMECs中，发现claudin-1表达增加，并促进内皮细胞膜上ZO-1稳定，证明miR-155抑制所引发的内皮屏障功能改善是由其直接靶蛋白claudin-1所介导的[4]。最新研究发现，在小鼠脑缺血模型中，选择性敲低血管内皮细胞miR-15a/16-1，可增强claudin-5的mRNA和蛋白表达丰度；在培养的小鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMECs)中，证实miR-15a/16-1簇直接结合到claudin-5的3'非翻译区(3'UTR)，同时干扰阻断miR-15a/16-1的表达，减少了OGD诱导的claudin-5 mRNA和蛋白表达的下调并缓解内皮屏障功能障碍，表明下调血管内皮miR-15a/16-1的表达可以抑制IS中BBB损伤[5]。

miR-210负调节新生儿大脑BBB的完整性，与其3'UTR互补的潜在靶基因为occludin和β-catenin[6]。在低氧损伤小鼠BMECs和人脑微血管内皮细胞系(human brain microvascular endothelial cell line，hCMEC/D3)中，查明claudin-1，连接黏附分子3(JAM3)和紧密连接相关蛋白1(TJAP1)是miR-212/132调控BBB作用的直接靶标[7]。

miR-143已被证明可以作为临床上早期诊断IS的标志物[8]。既往研究证实，下调miR-143可以保护BBB，在此基础上，又发现沉默miR-143不仅能够促进短暂性脑缺血(transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)小鼠和OGD损伤的bEnd.3细胞的内皮紧密连接蛋白(claudin-5、occludin、ZO-1)的表达，同时抑制二者间充质细胞标志物(collagenⅠ、collagenⅡ、α-SM)的表达水平，进而抑制内皮-间充质转变(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)的生物过程，减少BBB损伤[9]。

连接复合体是涉及各种关键细胞过程的结构蛋白组，已证明内皮连接完整性涉及多种疾病，在连接蛋白表达所有调节机制中，miRNA已成为其结构和功能特性特别有希望的靶标。以上miR-155、miR-210、miR-212/132、miR-143对连接蛋白表达及BBB完整性产生负性调控，提示抑制负性miRNA可能成为保护BBB完整性的治疗方法。

1.2 miRNA与内皮炎症脑缺血后的炎症涉及复杂的病理进展，起始于大脑常驻细胞的活化，循环白细胞如中性粒细胞，淋巴细胞和单核细胞的浸润以及免疫细胞释放促炎性介质。炎症既是BBB破坏的一个重要的病理因素，也是BBB破坏的病理后果；其中血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和内皮细胞-白细胞黏附分子(E-selectin)是中风后诱导炎症的主要内皮黏附分子。

实验证明，miRNA-126-3p/-5p过表达后，VCAM-1和E-选择素水平显著降低，从而减弱白细胞浸润、炎性因子分泌，以及升高ZO-1和occludin蛋白的表达，最终减少BBB破坏和脑梗死体积[10]。这表明，miRNA是微血管内皮细胞炎症基因诱导表达的主要调节因子。

在tMCAO和OGD损伤后，内皮中的miR-98表达水平显著降低，而miR-98的过表达减少了小鼠的梗塞面积，抑制中风后促炎性Ly6CHI白细胞向大脑组织的浸润，并降低了病变区域M1(活化)小胶质细胞的数量。通过体内荧光标记的葡聚糖渗透实验和体外跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance，TEER)实验，证明了上调miR-98的表达改善了BBB的通透性[11]。

let-7g*是let-7家族的一种变体。最初发现lethal-7(let-7)基因可控制秀丽隐杆线虫的细胞分裂和分化，并且是人类中最早的已知microRNA之一。现有研究表明，let-7在细胞分裂、分化，肿瘤形成和肿瘤抑制等生物过程中均发挥重要作用；同时，let-7家族参与神经退行性疾病的发生，并与调节炎症密切相关[12]。

在体内及体外脑缺血损伤模型中发现，过表达let-7g*能够抑制中风BBB的通透性升高，减弱脑组织炎症，限制CD3+CD4+T细胞和Ly6G+中性粒细胞的脑浸润，减少小胶质细胞活化和神经元死亡。这些结果证实了let-7g*的过表达具有神经保护作用[13]。

通过对MCAO小鼠脑缺血组织中提取的微囊泡进行检测发现，miR-27a在微囊泡中的表达异常升高；股静脉注射微囊泡后，MCAO小鼠脑梗死体积增大，BBB紧密连接蛋白损失加重，伴随Toll样受体4(toll-like receptor-4，TLR4)、核转录因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)和p38蛋白表达上调, 进而诱导下游炎症因子的释放，提示微囊泡miR-27a 与缺血脑组织BBB损伤和炎症信号通路TLR4、NF-κB和p38的激活密切相关[14]。

在缺血性脑卒中中，miRNA对脑微血管内皮屏障功能、BBB完整性以及炎症反应，均发挥着重要调控作用；这些新的发现，揭示了miRNA参与IS脑内皮损伤的新机制，提示通过miRNA可以调节神经炎症反应、修复受损BBB、重新建立正常脑血管功能，表明miRNA在IS中具有广阔的治疗前景。

1.3 miRNA与内皮细胞凋亡脑缺血会导致BMECs的功能损伤，而这一损伤继续发展的终极形式就是细胞的死亡。血管内皮细胞的死亡，直接导致脑微血管完整结构的缺失，而且是不可逆的，对IS的预后带来尤其严重的不良影响。有相当部分的BMECs是通过凋亡的方式死亡的。

研究表明miR-15a-5p和SNHG16与人BMECs的增殖和凋亡存在关联。miR-15a-5p通过靶向Bcl-2，抑制其表达，诱导OGD/R内皮细胞凋亡，从而促进I/R损伤[15]。

miR-199b-3p对BMECs 细胞活力、细胞周期以及细胞凋亡都具有重要影响。建立MCAO/R小鼠模型，发现miR-199b-3p在脑组织中表达降低，同时MAPK/ERK/EGR1轴激活、BMECs的凋亡增加；而用miR-199b-3p模拟物和U0126(MAPK/ERK/EGR1轴抑制剂)转染的BMEC细胞活力增强，在S期停滞的细胞增多，并且凋亡受到抑制。这表明，上调miR-199b-3p可以通过阻断MAPK/ERK/EGR1轴来抑制BMEC的凋亡，从而改善小鼠缺血性中风的损伤[16]。

干扰miR-143-3p表达，能够促进OGD大鼠BMECs的增殖、周期转化，并抑制凋亡。这一结果表明，下调miR-143-3p对于IS具有保护作用，它可能是脑卒中干预治疗的又一个潜在的靶点[17]。

细胞死亡是当今极为活跃的一大研究领域，各种旧的观点、认识被不断打破，新的进展层出不穷。迄今为止，已有自噬性死亡、程序性坏死、焦亡及铁死亡等一系列新的死亡形式被发现。这些死亡形式与IS脑微血管内皮细胞损伤有什么关系？而miRNA又在其中发挥了什么作用? 这些都还没有得到充分的研究，因此，在这方面是大有可为的。相关的深入研究，对于进一步阐释miRNA在缺血性脑损伤内皮功能障碍、BBB破坏中的作用是非常有意义的。

2 miRNA与周细胞

血管内皮细胞被周细胞覆盖并共同由基膜包绕，周细胞是BBB的重要组成部分，它从相邻细胞中接收、协调和处理信号，以产生不同的神经血管功能，包括微血管血流动力学的调节、BBB渗透性、毒性代谢物清除及血管生成[18]。在缺血损伤急性期，周细胞的缺失导致内皮与星形胶质细胞尾足连接断裂、BBB破坏和脑水肿[18]。

周细胞在大脑中表达鞘氨醇-1-磷酸受体(sphingosine-1-phosphate receptor,S1PR2)和N-钙黏着蛋白(N-cadherin)。萤光素酶测定法确定miR-149-5p可以直接与S1PR2基因的3′UTR结合，在tMCAO大鼠和体外BBB模型中证明，miR-149-5p过表达显著抑制周细胞的迁移和周细胞中N-钙黏着蛋白(N-cadherin)的表达，并改善BBB通透性；同时miR-149-5p对周细胞的保护作用被S1PR2沉默所逆转，证实了miR149-5p调节局部缺血诱导BBB通透性通过靶向S1PR2而实现[19]。

此外，在高糖和缺血的条件下，周细胞还可以摄取血管内皮细胞分泌的miR-503，从而减少毛细血管的覆盖范围，增加毛细血管通透性[20]。由于miRNA在周细胞中的研究仍处于起步阶段，因此需要在该领域进行更多更深入的研究以探索表观遗传调控，从而为IS治疗提供有希望的靶标。

3 miRNA与星形胶质细胞尾足

星形胶质细胞尾足作为重要成分参与形成血脑屏障。缺血性脑损伤后，BBB完整性受到破坏，渗透压的改变驱使水液进入星形胶质细胞，导致星形胶质细胞肿胀，功能障碍，最终死亡。

研究表明，水通道蛋白(aquaporin-4，AQP4)的上调与该过程密切相关，AQP4被认为是脑缺血后诱发血管性水肿的关键调节剂[21]。目前已知有两个miRNA，即miR-320a[22]和miR-130a[23]可以作为AQP4的调节剂，其中miR-130a可以与AQP4 M1启动子结合以抑制其转录，miR-130被鉴定为AQP4 M1亚型的强转录阻遏物。双荧光素酶报告系统证实，AQP4也是miR-29b的下游靶标，通过对胚胎神经元与星形胶质细胞比较发现，miR-29家族在星形胶质细胞中富集，且表达强于神经元[24]。在脑缺血小鼠中，miR-29b的过表达可靶向降低AQP4的表达，进而减少BBB损伤、脑水肿及梗死面积[24]。更有意义的是，在IS患者外周血及MCAO小鼠的血液及大脑中miR-29b的表达均显著下调，miR-29b表达与患者中风后NIHSS得分和MCAO脑梗死体积呈负相关，预示miRNA-29b可能成为预测中风后预后的一种新型循环生物标记物[25]。

综上，目前对于miRNA在IS血脑屏障调节作用研究中，主要针对各个组分，单一细胞，某个特异的miRNA，特异的靶向基因；由于脑组织结构的复杂性，BBB结构的多元性，需要进一步研究BBB各组分如脑微血管内皮和周细胞、星形胶质细胞之间的相互作用，或寻找交叉的miRNA，或发现共同作用的靶基因，以此探索miRNA调控IS中BBB的核心网络。

4 miRNA与MMPs

基质金属蛋白酶9(MMP-9)，也称为胶原酶B，是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)系列最重要的成员之一。正常脑组织中MMP-9低表达，在缺血性脑组织中MMP-9被过度激活，加重BBB泄漏、促进炎性反应及诱发神经细胞死亡[26]。MMP-9对BBB的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分及连接蛋白的降解起到关键作用，已被证明是BBB分解的关键效应物。缺血区的神经元、血管内皮细胞、胶质细胞及周细胞均可在炎症刺激下分泌MMP-9，进而直接或间接破坏BBB，促进血管通透性，增加脑组织损伤[26]。

在大鼠大脑缺血/再灌注损伤模型和OGD/R处理的bEnd.3细胞中发现MMP-9表达上调，BBB通透性增高，miR-539模拟物可逆转OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤；而在miR-539模拟物和pcDNA-MMP-9共转染的细胞中，这种保护作用则被取消。这证明过表达的miR-539通过靶向阻断MMP-9，抑制了BBB通透性的升高，达到脑保护的作用[27]。

小鼠侧脑室注射外源性agomir-132后，过表达的miR-132通过抑制MMP-9 mRNA的表达，减少了VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)和β-catenin的降解来保护BBB完整性；表明miR-132/MMP-9轴可能是减轻缺血性脑卒中BBB损害的新型治疗靶点[28]。

研究表明抑制MMP-9与组织纤溶酶原激活剂(the tissue plasminogen activator，tPA)联合疗法是有效的治疗策略，通过使用靶向MMP-9的siRNA或shRNA，可减少因BBB破坏而导致危及生命的并发症的发生。但是，MMPs抑制剂的后期给药对中风患者具有负面影响，抑制了血管生成和神经再生。因此，应该更加确切地对MMPs的不同亚型及其对应的miRNA在不同时间段的作用进行研究，为精准调控MMPs、保护及修复BBB完整性提供依据[29]。

5 总结与展望

IS引发的脑微血管通透性增加和BBB破坏，导致脑水肿，乃至脑出血的发生。防止BBB破坏是中风干预中的重要治疗策略。miRNA是通用的调节分子，几乎影响BBB结构和功能的各个方面；miRNA参与调节病理过程，例如血管内皮细胞紧密结构的破坏、凋亡和炎症，这些病理过程可能会加剧BBB功能障碍。对于脑卒中，虽然已经对循环miRNA的表达进行了研究，但miRNA在脑卒中后血脑屏障破坏中的具体功能仍然很大程度上未知[1-2]。深入探讨miRNA调控BBB结构和功能的机制，可能有助于发现新的药物靶标及开发基于miRNA的疗法。

相对于单一药物或单一基因靶点治疗，miRNA的调控作用几乎涵盖了脑缺血的所有病理损伤形式。一些miRNA，如miR-149-5p，miR-539，miR-21和miR-130均表现出维持脑缺血血脑屏障完整性的作用，因此具有成为治疗靶点的潜力。由于miRNAs种类和功能极其复杂，大多数专注于miRNA治疗用途的研究仍处于动物实验阶段。在动物研究中，静脉内注射miRNA agomir/mimic或miRNA hairpin inhibitor/antagomir是miRNA递送的最常见方式。但是，受伤的大脑并不是这些特殊药物的唯一靶标，因为miRNA inhibitor/antagomir也可能影响其他器官或系统。而且，一种miRNA可以作用于多种mRNA，从而调节一个基因网络，同时一种mRNA也能够受到多种miRNA的调控，因此，miRNA在临床治疗中的应用仍处在探索阶段，在这方面，将需要更多的工作来填补临床前研究与临床研究之间的差距。

但根据miRNA涉及到的疾病谱和时间表达的特性，发现并选择合适的miRNA作为脑缺血诊断和预后标志物是更切实可行的，与心肌梗塞不同，目前没有血液检测可诊断急性缺血性中风。miRNA由于其易于检测且在血样中具有良好的稳定性，已被研究人员建议作为缺血性卒中早期诊断的生物标志物[30]。一些miRNA，如前所述的miR-143、miRNA-15a/16-1、miRNAlet-7，以及miRNA-29b等已被鉴定为候选生物标志物，可在临床试验中发挥诊断作用。因此，在未来研究鉴定可预测脑缺血BBB损伤的miRNA是非常必要和可能的。

另外，由于miRNA调控多种补偿途径的能力，阻断或增强单个miRNA可能会产生多方面的作用。因此，处于非生理浓度的miRNA可能具有未知的靶标，通过靶向正常细胞，影响稳态，可能导致不良反应，在应用于临床治疗之前，仔细全面地研究确定其mRNA靶标是必须的。