网络药理学在中医药治疗自身免疫性疾病中的应用

唐加龙，周 莉，孙祖越，张立超

(1.上海中医药大学附属市中医医院药剂科，上海 200071；2.复旦大学药学院，上海 200031)

自身免疫性疾病(autoimmune diseases，AIDs)是一类难治性疾病，具有多种危害，严重影响了患者生活质量，其中类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、银屑病、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是临床主要疾病。寻找特异生物标志物有利于疾病诊断和防治[1]。中药天然药物苷类、生物碱类成分用于AIDs的治疗，新型炎症免疫反应软调节药物芍药苷-6-氧-苯磺酸酯也是来源于中药活性成分芍药苷的结构修饰产物，中药防治不良反应少，疗效确切[2]。

蛋白-蛋白互作 (protein-protein interaction，PPI)网络对调节细胞行为至关重要，联动的细胞信号网络相互作用可引发复杂疾病，基于PPI网络的构建分析鉴定具有疾病特异性的蛋白、基因等是生物标志物研究的新方法[3]。网络药理学通过PPI网络探索基因和miRNA等在疾病中的整体作用机制，从大数据中鉴定有价值的生物学靶标作为疾病生物标志物和药物靶点[4]。有研究[5-6]分别基于网络药理学和代谢组学、转录组学的整合策略发现了PPI网络预测筛选得到的枢纽基因与中药疗效标志存在潜在关联。AIDs发生机制诸如表观遗传调控作用复杂多样，表观遗传基因miRNA就可调节多个靶基因形成复杂分子调控网络参与疾病，中医药治疗与AIDs发病均是多途径、多靶点、多机制作用的综合效应，传统药理学方法研究较为困难[4,7]。

新兴的网络药理学研究方法在阐明疾病复杂病理机制和中药多成分、多靶点、多途径作用特点中得到广泛应用。本文拟对网络药理学在RA、银屑病、SLE等常见AIDs中的应用作一综述，以期为科研人员寻找AIDs相关新的生物标志物、药物靶点和中医药抗AIDs领域提供思路和方法。

1 网络药理学在中医药现代化研究中的应用

以网络为中心的药理分析方法在细胞或表型网络背景下考虑药物反应，在药物发现中理解药物多重作用的本质，为合理药物设计提供支持。网络药理学从网络层面系统分析生物系统、药物和疾病之间的相互作用，以生物网络平衡的整体观角度解释疾病的发生和指导新药发现[8-9]。

网络药理学的思想和方法应用于中药药理研究，作为一种新的方法，为中医药现代化提供契机。整体观和辨证论治是中医治疗疾病的主要特点，与网络药理学的整体系统特征相符合。中药复方是传统医学在病机和中药药性等中医药基础理论指导下临床防治疾病的主要形式，在治疗复杂疾病中有独特优势，目前网络药理学多应用于中药复方研究，常用于揭示中药复方治疗RA、心血管疾病、妇科疾病等慢性复杂疾病的药理作用机制，以及复方生物活性化合物筛选、新药靶发现等[8-9]。网络药理学的应用现状除了中药药理作用机制研究，还包括毒性机制评估，刘畅等[10]运用网络药理学方法揭示了山豆根导致神经系统受损引发神经毒性的主要15种毒性成分及其分子机制。由网络药理学发展而来的网络毒理学筛选中药毒性物质及阐释致毒机制，发现中药不良反应，促进中药安全性评价，也是对传统中药药性理论之“有毒无毒”的现代化研究[11]，未来从药理作用机制和毒性机制研究两方面入手，提高中药用药有效性与安全性，为中药“增效减毒”的效果提供依据。

在中医药现代化的结合与应用还有中药新药研发，包括药物重定位、单分子多靶点药物研发等内容。如对中药复方的药物重定位研究，即老药新用，以扩展新的临床适应症[8]。解释中药配伍规律[8]，揭示中药复方通过不同水平上对多个靶标和途径起作用的协同效应，证明中药配伍治疗疾病的有效性。中医证候研究，通过“疾病-表型-基因-药物”应用模型阐释其生物学基础[8]。中药研究热点质量标志物(Q-markers)的筛选, Q-marker用于中药及复方的质量控制，从功效Q-marker和毒性Q-marker两方面入手，建立基于“药效-毒性”关联评价的Q-markers为核心的质量评价体系，作为反映中药有效性与安全性的标记物确保疗效与安全用药[9,11]。

2 网络药理学在自身免疫性疾病中的应用

目前用于治疗AIDs药物主要包括传统抗风湿药和靶向生物制剂[2]。然而甲氨蝶呤等传统缓解病情抗风湿药容易产生肝肾损害等毒副反应，生物制剂不仅价格昂贵而且长期使用可致癌[7]。针对AIDs复杂的致病机制，中药具有良好免疫调节效果，雷公藤总苷和青藤碱等天然药物均能起到抗炎、免疫抑制作用，用于AIDs的治疗[2]。一项基于网络药理学的研究发现用于治疗RA的传统方剂清络饮可以缓解甲氨蝶呤诱发的毒性反应，表明中医药治疗不仅可以缓解病情疗效确切，而且安全性高[12]。

另一方面，AIDs在人群中具有高发病率与死亡率，新型生物标志物发现有利于疾病诊断和防治[1]。网络药理学技术对基因芯片等大数据分析，高效预测AIDs潜在标志物和药物靶点。目前基于分子靶点JAK研发的多种小分子抑制剂药物已在临床治疗AIDs取得明确疗效，如Tofacitinib、Decernotinib、Peficitinib均通过靶向JAK3治疗RA[2]。Jain等[13]通过分子对接虚拟筛选JAK3的有效抑制剂，发现化合物SCHEMBL19100243 (PubChem CID-76749591)与靶蛋白具有高亲和力，且该化合物的亲和力得分高于已知药物Tofacitinib。另有研究利用药效团模型从TCMD数据库虚拟筛选对AIDs的靶点组织蛋白酶S(Cat S)存在抑制作用的中药化合物，得到65个Cat S天然抑制剂，这些化合物存在于58种中药中，对58种中药与疾病关系进一步研究证实Cat S与一些中药治疗AIDs具有相关性[14]。提示我们以分子对接为重要研究手段的网络药理学在虚拟筛选中药活性成分中具有独特优势，是否可以从中药化合物中发现JAK3的天然抑制剂？筛选中药来源天然产物对于发现治疗AIDs的多靶点药物及先导化合物将是一条捷径。

2.1 探索中药作用机制网络药理学方法有助于揭示中药及复方通过有效成分群调节机体多个靶点与通路发挥的综合治疗作用模式。

Li等[15]通过全基因组表达谱芯片检测技术和网络药理学分析整合方法解析白虎加桂枝汤治疗RA的物质基础和药理机制。靶标预测技术获得白虎加桂枝汤候选靶标谱，与转录组分析得到的RA相关基因结合，构建“RA相关基因-白虎加桂枝汤靶标”相互作用网络，发现关键靶点TLR4、c-Fos/AP-1、IL2、TNF直接相互作用，显著富集于Toll样受体和T细胞受体通路。蛋白免疫印迹实验显示白虎加桂枝汤显著降低RA模型鼠的TLR4、c-Fos/AP-1、IL2、TNF的蛋白表达水平，揭示其通过调节TLR4-c-Fos-IL2-TNF信号轴恢复“炎症-免疫”系统平衡干预RA的作用机制。

来源于洋金花的醉茄内酯组分有抗银屑病作用，Cheng等[16]基于UHPLC/Orbitrap MS血清样本非靶向代谢组学和网络药理学阐明洋金花叶醉茄内酯对银屑病作用机制。代谢谱分析鉴定出20个脂质代谢相关标志物，网络分析得到439个关键治疗靶点。综合代谢组学与网络分析结果共有199个靶点在鞘脂代谢、VEGF和HIF-1等通路显著富集，醉茄内酯可能靶向血管生成和炎症反应两条主要途径参与银屑病，通过酶联免疫吸附法和蛋白免疫印迹实验实验进一步证实醉茄内酯可通过抑制HIF-1α/VEGF通路抑制炎症反应和血管增生起到治疗银屑病的作用。

升麻鳖甲汤是治疗SLE的中医经典名方，Huang等[17]对升麻鳖甲汤治疗SLE的分子机制进行研究，通过TCMID数据库查找出方中所含6味中药的390个化学成分及1 267个置信度较高的靶点，药物靶标功能显示升麻鳖甲汤在氨基酸、脂肪酸等代谢途径和趋化因子、Toll样受体、脂肪细胞因子等通路显著富集。疾病数据库综合检索到431个SLE相关基因，其中，药物靶标与疾病基因有96个重叠核心靶点，其余1 171个一般靶点，在SLE中分别发挥不同的免疫功能途径，但两者在Toll样受体信号通路又有重要联系，揭示升麻鳖甲汤多方面治疗SLE的系统疗效。

2.2 筛选生物标志物和药物靶点网络药理学通过生物信息学预测为高通量基因芯片数据处理提供研究方法， 通过预测分析基因、蛋白及miRNA在疾病中的整体作用，揭示其表达调控机制，在致病基因预测、药物靶标筛选扮演重要角色。筛选具有研究价值的生物学靶标，提高疾病诊断水平和发展个体化诊治。

Huang等[18]从基因表达谱数据库GEO筛选出RA与正常对照组的104个差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)(77个上调DEGs、27个下调DEGs)，GO分析显示上调DEGs涉及免疫系统调控等生物过程，下调DEGs参与对含氧化合物的反应等生物过程。PPI网络筛选得到JUN、CD79A、CCL5、LCK、CD27、CXCL13、CXCL9、IL7R、CD3D、CXCL10等10个枢纽基因，PPI网络模块化分析得到4个活跃模块，其中包含CCL5、CXCL6、CXCL9 CXCL10、CXCL13、ADCY2的模块富集分析发现通过趋化因子介导信号通路生物过程参与RA的发生，CCL5及其相关基因可作为RA潜在标志物及抗RA新药研发的重要靶点。

Gu等[19]通过UPLC-MS代谢组学技术鉴定出44个银屑病代谢途径紊乱相关代谢标志物，搜集与银屑病炎症反应、免疫应答、细胞增殖等3个系统病理过程相关靶标，分子对接计算代谢标志物与各系统蛋白的亲和力，构建代谢标志物-靶标网络，得到Chenodeoxycholic acid、5b-Cholestane-3a,7a,12a,25-tetrol、Estradiol度值中心性最高的3个代谢标志物，同样方法筛选出TNF-α、MAPK3、iNOS、eNOS、COX-2、mTOR 6个广泛参与以上3个系统的重要靶标蛋白，可作为银屑病药物靶点深入研究。

Kong等[20]通过筛选GSE65391、GSE49454基因表达数据集鉴定了女性LN-/LN+与男性LN+的90个DEGs，其中70个导入STRING数据库存在相互作用以构建PPI网络，从PPI 网络筛选出DDX58、IFI44、IFI44 L、STAT1、MX1、MX2、OAS1、OAS2、OAS3、IFIT1、IFIT2、IFIT3、XAF1、ISG15、RASD2等16个枢纽基因，STAT1、DDX58、IFIT1存在强烈相互作用。张济等[4]基于网络药理学方法预测了SLE患者中异常表达的miR-410受其调控，且与SLE发病相关的FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等靶基因，靶基因参与细胞程序性死亡、细胞增殖、粒细胞分化等生物过程，在肿瘤、细胞因子-细胞因子受体相互作用、胶质瘤等通路显著富集，揭示miR-410通过调控多靶点、多途径参与SLE的发病过程。

2.3 为药物组合提供研究方法网络药理学为中药配伍和中西药物联用等组合药物研究提供方法。清络饮是治疗热证型RA的传统中药配方组合药物，网络药理研究显示君药苦参与其它几味中药通过靶向血管生成、炎症和免疫应答等生物过程发挥协同作用，臣药和佐使药均起到增强君药的治疗作用，黄柏还能通过PTGS1等脱靶基因拮抗苦参的不良反应[21]，体现中医基础理论中“君臣佐使”和“七情配伍”中“相须”的配伍规律。Zuo等[12]通过网络分析进一步证明方中苦参和黄柏、青风藤是发挥抗风湿作用主要组分，苦参碱、小檗碱、青藤碱分别是三味主药的重要活性成分。利用网络靶标法评估清络饮与传统抗风湿药甲氨蝶呤联合用药的可行性，网络分析发现清络饮可部分抵消甲氨蝶呤诱导的氧化应激反应和能量代谢的毒性相关信号改变，代谢组学分析也发现清络饮在叶酸代谢方面对甲氨蝶呤表现出拮抗作用，综合结果揭示甲氨蝶呤与清络饮联合用药可减少其副作用，显示中西药物联用可达到“增效减毒”中“减毒”的目的，为提高临床治疗效果提供理论依据。

2.4 中成药再评价由于很多中成药药效物质基础不清，药理机制不明，其有效性和安全性仍存在诸多疑问，网络药理学应用于中成药成分挖掘、机制探索和不良反应预警对其再评价有重要意义。

Fan等[22]通过代谢组学、网络分析、分子对接方法研究八味龙钻颗粒抗RA的物质基础和作用机制。1H NMR发现16种八味龙钻颗粒治疗的代谢物变化，通过Metscape获得16种差异代谢物的33个候选蛋白，以及疾病数据库得到的42个RA靶标，利用UPLC-Q-TOF/MS技术鉴定的20个成分与75个RA相关蛋白分子对接发现乌药碱和橙皮苷对接得分最高，构建的“化合物-蛋白-差异代谢物-疾病”相互作用网络乌药碱和橙皮苷呈现最高相关度，表明二者是八味龙钻颗粒的潜在活性成分，为建立基于功效成分群的八味龙钻颗粒生产过程控制体系提供参考。富集分析发现八味龙钻颗粒通过对甾体激素生物合成、mTOR信号通路、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、酮体合成与降解等生物过程的调节发挥抗风湿作用。王晓月等[6]利用全基因组表达谱和miRNA表达谱芯片检测技术和网络分析筛选出hsa-miR-4720-5p，hsa-miR-374b-5p 和hsa-miR-185-3p 作为雷公藤多苷片治疗RA的疗效候选标志，并基于3个疗效标志构建了雷公藤多苷片治疗RA的药效预测模型以减少不良反应发生，提高用药安全。

2.5 开发中药来源多靶点分子药物多靶点药物的开发有望治疗慢性复杂疾病，中草药是天然药物研发主要来源，多靶点药物对于AIDs等复杂疾病可以提高疗效，减少副作用。雷公藤总苷、青藤碱均是可用于治疗AIDs的中药天然药物[2]，网络药理学研究发现雷公藤红素、雷公藤甲素以及青藤碱作用于RA、SLE的多靶点机制。雷公藤红素可通过调节MMP-9、COX-2、c-Myc、TGF-β、c-JUN、JAK-1、JAK-3、IKK-β、SYK、MMP-3、JNK和MEK1等多个信号蛋白对RA的Th1和Th2细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞的功能形成抑制作用[23]。通过调节VEGFA、CAT、TP53、IL-10、TNF、IL-6、IL-1β、JUN、MAPK1、AKT1、CASP3、MMP9、EGFR等信号蛋白及MAPK通路起到抗SLE作用，分子对接验证了雷公藤红素与CAT、IL-10、IL-1β、CASP3、TP53、VEGFA等靶点之间的特定相互作用，相互作用的主要形式为氢键和π-π叠加，类似于糖皮质激素抗SLE的结合形式，提示雷公藤红素抗SLE的分子机制可能与糖皮质激素相似，可用于SLE治疗的中药免疫抑制剂[24]；雷公藤甲素通过CD274、RELA、MCL1、MAPK8、CXCL8、STAT1、STAT3、c-JUN、JNK、c-Fos、NF-κB、TNF-α调节RA患者Th1、Th2细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞的活化[25]；青藤碱通过HSP90AA1、CTNNB1、RAC1、ERBB2、KIT、VAV2、HDAC6、MAP3K3、VWF、KPNB1、F13A1、MAGI1、SAMHD1、NFAT5、PRKD2、GRK6 共16个关键靶点抑制血管生成、滑膜增生和骨质破坏改善RA病情[26]。这些中药单体成分是一类天然抗AIDs的单分子多靶点药物，也为新药开发提供先导化合物选择。

2.6 识别中药质量标志物(Q-markers)中药Q-markers是刘昌孝院士提出用于控制中药质量的新概念，其核心理念是反映中药治疗疾病本质特征，建立中药专属的质量评价标准，基于网络药理学识别Q-markers的研究策略是构建可视化候选质量标志物网络，通过中药成分、靶点、通路之间的网络关系为中药Q-markers挖掘和分析提供依据[11]。梁健钦等[27]利用网络药理学预测四方藤小复方治疗RA的Q-markers，从构建的“药材-化学成分-作用靶点”网络分析得出24个与RA作用靶点有关的化合物，再结合Q-markers有效性的基本特征对24个潜在Q-marker进一步筛选，共得到橙皮苷、芹菜素、黄连碱、白藜芦醇、岩白菜素、欧前胡素、蛇床子素、氯化两面针碱、芳樟醇、乙氧基白屈菜红碱、芝麻素等11个成分可作为四方藤小复方抗RA的Q-markers用于该制剂质控研究。

2.7 阐释中医证候生物学基础中医证候是对复杂疾病进行个体化诊断和治疗的重要临床表现，临床治疗常采取“同病异治”和“异病同治”治法，讲究“方-证-病”对应，关键在于证候异同，证同同治，证异异治，网络药理学具体应用于研究“药-证”对应的生物学基础，诠释病机理论的现代科学内涵。RA患者中医辨证可分为寒证和热证，中医辨证施治采用不同的方剂，清络饮是治疗热证RA方剂，已有研究[21]运用网络药理学阐明其作用机理，乌头汤(WTD)是治疗RA寒证的经典方剂，Zhang等[28]以WTD为例揭示治疗RA寒证的网络调节机制，网络分析发现WTD作用于RA寒证的NCOA2、NCOA1、CREBBP、RXRA、MED1、PPARG等6个主要靶标，与过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR-γ共激活因子产热通路密切相关，随后利用体内动物模型和体外细胞实验得到验证，提示PPAR-γ共激活因子产热通路可能是WTD缓解RA寒证的潜在药理作用靶点之一，PPAR-γ激动剂可能是一种RA寒证患者个体化治疗方法。红斑狼疮与RA有相同的自身免疫发病机制，中医辨为相同症候，网络药理学发现火把花根片(HBHGT)在治疗两种疾病中无论靶点还是通路都有极大相似性，发挥“异病同治”的关键靶点有EGFR、CBL、LCK等13个核心靶点，主要信号通路是受体酪氨酸激酶通路，揭示了HBHGT对LE和RA的共同作用机制，显示中药治疗疾病的多功能效果[29]。

2.8 设计建立疾病天然药物数据库银屑病中药数据库(the Psoriasis Database of Traditional Chinese Medicine，PDTCM)是第一个基于高通量虚拟筛选和网络分析等系统药理学方法建立的银屑病数据库，该数据库包含与银屑病相关的38个中医验方，来自1 424种药用植物、动物及微生物的34 373个化合物，44个蛋白和76个生物标志物。PDTCM的建立将有助于银屑病先导化合物的发现和促进对中药方剂分子机制的理解，为治疗银屑病相关天然产物的系统研究提供工具，一个可供用户获取银屑病相关中药的系统药理学数据的长期资源[30]。

3 结语与展望

生物信息学方法在药理学的运用促进了网络药理学的发展，采用网络药理学方法处理海量基因组、蛋白组数据，从大数据中寻找重要靶标，促进生物标志物和中药作用靶点的发现，提高疾病诊断、防治、预后的精确度。在网络医学时代，新的生物标志物的发现依赖于多组学综合策略[3]。单纯网络药理学研究无法体现中药在机体内部真实的动态情况，并且存在数据库整合不到位，数据准确性等诸多问题。本文中多组学数据集综合分析为整体水平中医药研究提供途径，网络药理学结合其他组学(代谢组学、基因组学、转录组学)的数据分析，实现组学间数据的多重相互联系。此外网络药理学与蛋白组学技术联合，能够直观展示药物在蛋白水平上的调控作用，建立相对全面的药物-蛋白相互作用网络。

综上所述，中药网络药理学的未来发展需要多组学技术联合以及生物信息学、生物芯片等相关学科与技术的共同发展，多组学、多学科结合策略是未来中药研究的重要方向。