基于网络药理学探究桃红四物汤治疗类风湿性关节炎作用机制

黄 石，段贤春，潘凌宇，陈 燕1，，汪永忠

(安徽中医药大学1.药学院，2.第一附属医院药学部，安徽 合肥 230031)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以滑膜增生、关节破坏为特点的自身免疫系统疾病，主要影响外周关节，也可累及关节外器官，如皮肤、心脏、肺、眼睛等[1]；其病理变化主要从关节滑膜的破坏开始，随之出现关节软骨、骨破坏，进而导致关节功能障碍，甚至关节功能丧失。RA的发病机理尚不明确，西医治疗主要应用非甾体抗炎药、改善病情的抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂等，虽然这些药物能有效控制RA的发作，极大的提高RA的临床疗效，但其副作用较多，患者依从性不高，所以寻找新的治疗方法极具意义。而中药因其治疗RA疗效显著、副作用小、耐受性好，近年来日益受到关注。

桃红四物汤出自清代吴谦等所著的《医宗金鉴》，由桃仁、红花、当归、熟地、白芍、川芎六味中药组成。桃红四物汤的功效为活血化瘀、养血补血，临床常在该方基础上进行药味加减，用于治疗妇科、心脑血管及RA等疾病，Fu等[2]发现桃红四物汤通过Wnt/IP3R/CAMKII途径减轻缺血再灌注大鼠成肌细胞钙超载和炎症反应；Duan等[3-4]运用质谱分析技术得到桃红四物汤入血及入脑成分，再结合高通量测序技术揭示桃红四物汤治疗实验性大鼠大脑中动脉栓塞的潜在靶点；李肖等[5]将桃红四物汤与麻黄附子细辛汤通过加减治疗RA，疗效显著。但桃红四物汤发挥治疗RA作用的药效机制有待进一步阐明。网络药理学的整体性、系统性与中医药的整体观、辩证论等基本理论相吻合，应用于中医药可以很好的阐述其物质基础与作用机制[6]。据此本研究采用网络药理学研究手段，探讨桃红四物汤治疗RA的可能作用机制，为RA的治疗提供思路和参考。

1 材料与方法

1.1 桃红四物汤活性成分的获取基于课题组前期超高效液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MSE)收集的桃红四物汤体外化学成分[7]，并与中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)中的结果进行整合，得到可能存在于桃红四物汤中的化合物。将这些化合物按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、类药性(drug-like, DL)≥0.18进行筛选，选出最可能发挥作用的有效活性成分。

1.2 桃红四物汤成分的靶点预测使用Zinc网站(zinc.docking.org)和PubChem网站(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)下载活性成分的mol2文件或SDF文件，将其上传至PharmMapper数据库(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)，PharmMapper可以对成分的潜在靶点进行识别，勾选“Homo Sapiens”，等待预测结果。

1.3 RA疾病靶点的获取通过OMIM数据库(http://omim.org)、GeneCards数据库(http://www.genecards.org)搜索“rheumatoid arthritis”，获取RA靶点。

1.4 药物成分靶点与疾病靶点映射获得桃红四物汤相关靶点以及RA的靶点之后，取两者的交集靶点蛋白，这样可提高筛选靶点的准确性，增大结果的可信性，再用Cytoscape 3.7.1软件构建“成分-靶点”网络，利用软件中的“Network Analyzer”功能对“成分-靶点”网络进行拓扑学分析，桃红四物汤的成分和靶点是网络中的节点(node)，边(edge)代表中药成分和其作用靶点之间的联系。根据拓扑分析结果筛选出桃红四物汤作用于RA的关键化合物。

1.5 PPI网络的构建及关键靶点筛选将获得的交集靶点上传至 STRING 数据库(http://string-db.org/cgi/input.pl)，构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络，将蛋白种类设置为人源，最低相互作用阈值(minimumrequired interaction score)设置为“highest confidence(0.900)”，同时设置隐藏游离点，获得PPI网络。下载PPI网络数据导入Cytoscape 3.7.1软件，借助其“Network Analyzer”功能对PPI网络进行拓扑分析，度值(degree)、介数(betweenness centrality，BC)均大于平均值的节点为关键靶点。

1.6 富集分析及“桃红四物汤-组方药材-成分-靶点-通路”网络图构建将“1.4”项结果中的交集靶点基因导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov)进行GO功能富集和KEGG通路富集，其中GO分析包括生物过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)以及分子功能(molecular function，MF)3个部分，设定FDR值获得GO与KEGG富集结果，根据富集结果做气泡图。利用Cytoscape 3.7.1软件构建“桃红四物汤-组方药材-成分-靶点-通路”图。

1.7 关键成分与关键靶点的分子对接验证将“1.4”项结果中排名前三的关键化合物在TCMSP数据库中获取其mol2格式文件，PPI网络中排名前三的关键靶点蛋白，在PDB数据库(http://www.rcsb.org)中获取其结构，利用AutoDock vina软件将关键活性成分与关键靶点进行分子对接，以结合能作为评价指标对对接结果进行评价，并用pymol软件对结果进行展示。

2 结果

2.1 桃红四物汤活性成分筛选桃红四物汤所含107种有效成分经筛选后，共得到38个活性成分，其中桃仁3个、红花6个、当归18个、熟地2个、白芍3个、川芎16个，熟地与红花的共有成分1个，川芎与当归的共有成分7个，白芍、红花与熟地的共有成分1个，见Tab 1。

Tab 1 The active ingredients of Tao-Hong-Si-Wu decoction

2.2 桃红四物汤活性成分-靶点筛选整合PharmMapper网站上桃红四物汤相关靶点，得到8 450个。去除重复值后，得到相关人类基因靶点共441个。

2.3 疾病-靶点筛选在OMIM数据库、GeneCards数据库搜索“rheumatoid arthritis”，获取RA疾病靶点，剔除重复，共得到4 167个。

2.4 药物活性成分靶点与疾病靶点的映射将桃红四物汤活性成分对应的441个作用靶点与4 167个RA相关靶点取交集，得到桃红四物汤潜在作用于RA疾病靶点291个，如下Fig 1，其中桃仁对应169个，红花对应196个，当归对应237个，熟地对应163个，白芍对应203个，川芎对应225个，构建“成分-靶点-疾病”网络图。网络中有329个节点(桃红四物汤中化合物节点38个，靶点基因节点291个)，5 037条边。在网络中，一个节点的度值表示网络中与节点相连线的条数，度值越大则表示该化合物发挥作用的可能性越大。利用Cytoscape 3.7.1中的“Network Analyzer”对网络关系的特性进行拓扑学分析，网络中各节点的平均度值为129.153 8，平均介数为0.024 8。度值、介数均超过平均值的化合物节点有11个，见Tab 2，推测这些化合物可能是桃红四物汤发挥治疗RA作用的关键化合物。

Fig 1 Intersection of predicted targets of THSWD and RA

2.5 靶点PPI网络分析及关键靶点的筛选将“2.4”项下得到的291个靶点基因导入 STRING 数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction Networks，PPI)网络。PPI网络中包含232个节点和1 046条边，表明该网络中有232个靶点可以发生相互作用，共产生1 046次相互作用关系。拓扑学参数显示，网络中各节点的平均度值为9.017 2，平均介数为0.010 1。度值、介数均超过平均值的节点有33个，由Cytoscape软件进行可视化展示，其中，节点大小与颜色表示度值的大小，节点越大，对应的度值越大，如Fig 2所示，靶点具体信息见Tab 3，推测这些靶点可能是桃红四物汤治疗RA的关键靶点。

Tab 2 Basic information of hubcompounds of THSWD in RA treatment

2.6 富集分析利用DAVID数据库对桃红四物汤治疗RA的291个靶点进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路富集分析(FDR<0.01)，GO富集分析中包括BP的相关条目59个；MF的相关条目32个；CC的相关条目15个。BP主要包括凋亡过程的负调控、类固醇激素介导的信号通路、肽基酪氨酸自磷酸化等；MF主要包括类固醇激素受体、蛋白酪氨酸激酶活性等；CC主要包括胞浆、胞外体等。将筛选出的前10个BP、MF、CC通过R语言相关程序作气泡图，见Fig 3。KEGG通路富集筛选得到34条信号通路(FDR<0.01),与RA相关的通路有FoxO,Ras及VEGF等14条，见Fig 4。

2.7 “成分-靶点-通路”网络构建将桃红四物汤治疗RA的38个成分，291个靶点以及KEGG富集分析的14条可能与RA相关的通路等构建“桃红四物汤-组方药材-成分-靶点-通路”的网络图，如Fig 5所示。

2.8 分子对接验证选取PPI 网络中排名前3的关键靶点蛋白(MAPK1、SRC、PIK3R1)与表2的排名前3的关键活性成分(Hydroxysafflor-Yellow-A、Rutin、Kaempferol)进行对接，见Tab 4，其中Rutin与SRC的结合性最好，pymol可视化后见Fig 6。

3 讨论

RA在中医理论中属于“痹证”的范畴，主要由于机体气血虚弱、正气不足，导致风寒湿邪侵袭机体，停滞于肌肉筋膜、骨骼关节，加之寒邪收涩凝结，最后引起关节重着、冷痛、屈伸受限，甚至关节变形的一种慢性疾患[8]。《类证治裁·痹证》说：“痹久必有瘀血”，祖国医学亦有“不通则痛，通则不痛”之言。作为活血化瘀的代表方剂桃红四物汤，可使RA患者关节经络中的瘀滞消失从而减轻疼痛。现代药理研究证实，桃红四物汤有抑制骨质疏松、填充骨髓等功效，可使RA患者的骨质疏松化恢复正常，还可以降低炎症，使毛细血管有充分的通透性，减少炎症渗出，改善血液循环，促进炎症吸收[9]。

Tab 3 Basic information of hub targets of THSWD in RA treatment

Tab 4 Molecular docking results

通过对38个成分和291个交集靶点构建“成分-靶点-疾病”网络进行拓扑分析，结果表明成分中的羟基红花黄色素A(hydroxysafflor-yellow-A)、山奈酚(kaempferol)等11个化合物可能是桃红四物汤发挥治疗RA作用的关键活性成分。羟基红花黄色素A已被证实可缓解多种炎症因子的表达，姚弘毅等[10]发现羟基红花黄色素A可通过降低骨性关节炎大鼠不同部位相关炎症因子含量及抑制Notch1信号通路激活进而减轻软骨损伤。山奈酚[11]可通过阻断MAPK通路和生长因子受体3-核糖体S6激酶2信号轴，来发挥治疗RA作用。

PPI网络结果显示，桃红四物汤治疗RA的核心靶点包括AKT1、MAPK1、JAK2等。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的家族成员之一，AKT1可调控mTOR信号通路，减少细胞凋亡，上调AKT1蛋白的表达，可抑制IL-1β诱导的软骨细胞增殖[12]。MAPK1即丝裂原活化蛋白激酶1，MAPK参与了RA关节的炎症和组织破坏，与RA病理状态的维持及病情进展密切相关。JAK2属于酪氨酸蛋白激酶家族，RA患者滑膜中细胞因子与JAK2结合，从而激活JAK/STAT信号通路，致使关节破坏，邓龙飞等[13]发现威灵仙总皂苷通过抑制滑膜组织中JAK2mRNA表达及p-JAK2/JAK2 相对表达，进而调控JAK/STAT信号通路发挥治疗RA作用。以上结果提示，桃红四物汤可能通过调控软骨细胞凋亡、炎症细胞因子激活、细胞自噬或凋亡等途径的靶点发挥治疗RA作用。

Fig 2 PPI network of THSWD in treating potential targets of RA

Fig 3 Bubble diagram of GO function enrichment of potential targets from THSWD for RA treatment

Fig 4 Bubble diagram of KEGG enrichmentof potential targets from THSWD for RA treatment

KEGG通路富集结果表明，桃红四物汤通过调控FoxO、Ras及VEGF等信号通路发挥对RA的治疗效果，其中已有多条通路被证实参与了RA的发生发展。FoxO属于叉头框蛋白(forkhead box，FOX)家族中的一个亚类，当机体刺激FoxO时，修复和自由基清除等功能的基因表达，使细胞凋亡、修复和降解的转录程序启动，同时几种前凋亡基因也诱导损伤或异常细胞发生凋亡[14]。一般而言，氧化应激的信号汇集到下游，激活效应器caspase-3，活化的caspase-3剪切Akt，引起PI3K/Akt抑制，进而促进FoxOs蛋白转位入核，激活其转录活性，促进前调亡基因(如Bim和Fas)和细胞生长停滞与DNA损伤修复基因(Gadd45a)的表达，诱导细胞周期阻滞和细胞调亡，从而清除受损或异常的细胞。RA进程中的氧化应激反应通常伴随着FoxO3a蛋白含量的变化，且FoxO3a的活性被抑制，则谷胱甘肽过氧化物酶表达降低，使ROS的清除减少，机体的抗氧化能力减弱[15]。

Fig 5 “THSWD-prescription composition-prototype components- targets- pathways” network

Fig 6 Molecular docking diagram

Ras是单聚体鸟苷三磷酸结合蛋白，Ras能广泛激活MAPK等通路对细胞凋亡起负向调节作用，一些药物可能就是通过Ras信号通路介导的细胞内反应发挥治疗RA作用。另有研究表明[16],Ras/Raf/MEK/ERK信号通路不仅能够直接通过上调自噬相关蛋白表达诱导自噬，而且还能通过间接激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬的发生。VEGF即血管内皮生长因子，VEGF在RA患者滑液和血清中大量表达，在炎症发生时，VEGF的分泌可增高3～20倍，直接参与了滑膜血管新生，李梦等[17]发现铁筷子醇提物可通过下调佐剂性关节炎大鼠体内VEGF的表达发挥治疗作用。

分子对接结果，靶点蛋白与活性成分之间的结合活性度越高，结合能越小，表示其对接性越好，一般≤-5.0 kJ·mol-1则表示具有较好的结合性[18]，从结果可以看出，桃红四物汤的主要活性成分与靶点蛋白结合能均<-5.0 kJ·mol-1，推测这些活性成分在治疗RA中发挥重要作用。

综上，网络药理学的研究结果显示桃红四物汤通过作用于多个靶点、多条通路共同实现对RA的治疗作用。这些靶点和通路主要涉及细胞凋亡、细胞生长因子等，提示桃红四物汤治疗RA的作用机制与干预细胞凋亡、促进血管新生相关，为后期桃红四物汤治疗RA的深入研究提供基础。