嗜碱性粒细胞活化试验在过敏性疾病应用中的研究进展①

张 敏 崔振泽 李 悦 徐 超

（大连市儿童医院，大连116000）

虽然世界医疗水平、工业发展程度以及感染性疾病的防治水平不断提高，但是过敏性疾病的发病率却在全球呈现增高的趋势，严重影响公共健康，已成为21 世纪需着重研究和防治的疾病之一［1］。临床工作中主要根据相关病史以及体内和体外试验对过敏性疾病作出诊断，但因描述病史有一定的不精确性和主观性，故主要诊断依据为体内试验和体外试验［2］。目前常用的体内试验包括皮肤点刺试验、斑贴试验、激发试验；常用的体外试验包括过敏原吸附试验、嗜碱性粒细胞组胺释放试验以及特异性IgE 及IgG 检测等［3］。其中体内试验存在诱发过敏反应的潜在风险。传统体外试验具有易干扰、特异度低等缺点，如特异性IgE 检测不能评估过敏性疾病的发病风险及严重程度［4-5］；嗜碱性粒细胞组胺释放试验（histamine release test，HRT）由于组胺来源的多样性使得其敏感性低于体内试验等［6］。因此临床工作中亟需进一步探索安全简便有效的辅助诊断过敏性疾病的检测方法。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）可快速简便的通过识别免疫标志物来区分细胞类型，并对某种特定细胞进行定量分析［7］。微流体技术（microfluidic technology）是在FCM基础上进一步发展起来的一种高精度处理小体积流体的技术［8］。近年来，在上述两种技术发展的基础上，嗜碱性粒细胞活化试验（basophil activation test，BAT）作为一种辅助诊断过敏性疾病的新方法应用而生。本文就嗜碱性粒细胞的相关概念、分别基于FCM 及微流体技术的BAT及其对过敏性疾病辅助诊断的应用价值做一综述，以期为今后过敏性疾病的临床诊断提供相关理论指导。

1 嗜碱性粒细胞的相关概念

1.1 嗜碱粒细胞 嗜碱性粒细胞于1879年由EHRLICH 发现，是迄今为止研究较少的一类白细胞。由于嗜碱性粒细胞占外周血白细胞的比例很小（＜0.3%），所以既往通过分离培养来获得纯的嗜碱性粒细胞样本进行研究，进而检测并分析其释放组胺、白三烯及细胞因子等情况［9］。然而因采血量大，步骤繁多，耗时较长，影响因素多等局限在很长一段时间内限制了该细胞的研究进展。

近年来随着科技水平的提高，嗜碱性粒细胞的提纯方法也逐渐兴起，如流式细胞分选术以及磁珠负性选择和密度梯度离心相结合的纯化方法，使得高纯度的嗜碱性粒细胞更为简便，因此科学界对嗜碱性粒细胞的研究掀起了新的热潮。有学者曾将此现象称为“ 一个被忽视的小群体重新赢得了尊重”［10-11］。

嗜碱性粒细胞源自骨髓造血多能干细胞，在骨髓中成熟后分布于外周血［12］。该细胞广泛存在于生物界，如在哺乳类、两栖类和鱼类等均存在［13］。正是该细胞存在的广泛性揭示了其在生命活动过程中的必要性，具体表现为该细胞在IgE介导的Ⅰ型超敏反应中扮演着重要的角色。其胞浆中的嗜碱性颗粒内贮存有大量的炎症介质，如组胺、白三烯、抗微生物肽、趋化因子及白细胞介素等［14］。当机体初次接触过敏原时，在体液免疫作用下浆细胞便产生针对过敏原的特异性IgE 抗体，这些特异性IgE 抗体可与嗜碱性粒细胞及肥大细胞表面的高亲和力IgE 受体（FcεRⅠ）结合，使嗜碱性粒细胞和肥大细胞处于致敏状态。当机体再次接触同种过敏原时，即使很小剂量进入机体，便可很快与致敏嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE 结合，通过交联作用使上述致敏细胞激活、脱颗粒并释放胞浆中的炎症介质，诱发不同程度的过敏反应，严重时可产生致命的全身性反应。因此嗜碱性粒细胞也被称为“循环中的肥大细胞”，具有免疫调节和免疫应答的作用［15］。

嗜碱性粒细胞通过活化来参与多种变态反应性疾病，如过敏性支气管哮喘、荨麻疹等［16-23］。活化是其发挥免疫作用的关键。一方面与该细胞活化分泌多种炎症介质相关，如过敏性支气管哮喘作为常见的气道过敏性疾病，在其发病过程中处于致敏状态的嗜碱性粒细胞在变应原的刺激下活化分泌组胺、白三烯、嗜酸性粒细胞趋化因子、中性粒细胞趋化因子及血小板活化因子等炎症介质，可使支气管黏膜血管通透性增加，进而介导气道炎症的产生、气道平滑肌的收缩及气道黏液的分泌，使气道处于高反应性状态，诱导支气管哮喘的发生［16-17］；再如荨麻疹作为一种临床常见的皮肤过敏性疾病，有研究报道其发病与嗜碱性粒细胞活化分泌组胺、花生四烯酸代谢产物等炎症介质相关，在这些炎症介质的作用下皮肤及黏膜小血管扩张、毛细血管通透性增加，进而出现皮肤潮红、风团样皮疹的临床表现［18］。另一方面与该细胞活化后诱导Th1/Th2 免疫失衡相关，主要表现为Th2 免疫应答的增强。目前学术界普遍认为支气管哮喘的气道慢性炎症与Th1/Th2 细胞比例失衡相关，具体表现为Th2 细胞数目的增加及功能的增强［19-20］。而有研究报道嗜碱性粒细胞在活化后可产生Th2 型细胞因子如IL-4、IL-13 等，可介导局部引流淋巴结内Th0 向Th2 细胞分化，使Th2 免疫应答增强的同时Th1 免疫应答得到抑制，同时可促进B 细胞分泌IgE 抗体［21-22］，进而来参与支气管哮喘的发生；同样荨麻疹的发病亦与相应变应原诱导的以Th2 细胞为主的免疫失衡相关［23］。

目前研究发现嗜碱性粒细胞的活化途径包括IgE 介导的活化和非IgE 介导的活化。其中经典的活化途径为IgE 介导的活化，表现为：当机体首次受抗原刺激后，可产生抗原特异性IgE，并与体内已存在的IgE 受体结合，其中嗜碱性粒细胞表面常规表达有高亲和性IgE 受体，故当其与抗原特异性IgE 结合后可使嗜碱性粒细胞致敏［24］。当相同抗原再次进入机体并与致敏嗜碱性粒细胞膜表面的抗原特异性IgE 结合后，嗜碱性粒细胞可通过胞吐的过程来释放胞浆嗜碱性颗粒内的相关炎症介质，如嗜碱性粒细胞趋化因子和组织胺等，进而参与过敏反应的发生。非IgE 介导的活化途径包括IgG1、IgD、细胞因子、蛋白酶以及Toll 样受体配体和补体等介导的途径［25］。

1.2 嗜碱性粒细胞表面的相关标志物 嗜碱性粒细胞活化脱颗粒释放各种炎症介质的同时，活化相关膜标志物也在发生改变［26］。 主要包括CD45、CD203c、CD63、CD69、CD123、CCR3、CRTH2、CD13、CD107a、CD107b、CD164 等［27-28］。其中最常用的为CD203c和CD63。

1.2.1 CD63 CD63 又称溶酶体相关膜蛋白3，表达于多种细胞膜表面，如活化的嗜碱性粒细胞、肥大细胞、血小板及嗜酸性粒细胞等［29-32］。作为嗜碱性粒细胞活化的特异性标志物，对处于未激活状态（静息状态）的嗜碱性粒细胞而言，CD63主要表达于胞质内的嗜碱性颗粒膜表面，而在细胞膜表面几乎不表达，表达量＜5%；对受抗原刺激处于活化状态的嗜碱性粒细胞而言，其胞质的嗜碱性颗粒逐渐向细胞膜靠近并与之发生融合，CD63发生由胞质颗粒膜向细胞膜的转移，使得其在细胞膜表面的表达量增多［33-34］。根据CD63 在嗜碱性粒细胞活化过程中表达上调的特点，便可对处于激活状态的嗜碱性粒细胞进行检测，并计算其活化率。此外有学者进一步提出通过量化嗜碱性粒细胞活化后细胞膜表面CD63 的表达量来评估嗜碱性粒细胞受变应原刺激后的活化程度，进而间接反应机体发生过敏反应的程度［8］。

1.2.2 CD203c CD203c 是一种Ⅱ型糖基化跨膜分子，其表达于嗜碱性粒细胞以及肥大细胞的细胞膜表面，是嗜碱性粒细胞的识别标志物及活化标志物之一［35］。CD203c 既表达于静息状态的嗜碱性粒细胞，也表达于处于活化状态的嗜碱性粒细胞。但不同的是其表达量随着细胞活化程度的变化而变化，具体表现为在处于静息状态的细胞表面低表达，而在受抗原刺激处于激活状态的细胞表面表达量则上调。此外有研究表明处于相同活化状态的嗜碱性粒细胞表面CD63 和CD203c 的表达情况存在差异，后者的表达量明显优于前者［36-37］。因此笔者认为根据CD203c 的上述表达特点，可利用FCM对嗜碱性粒细胞进行检测，并通过计数CD203c 表达量上调的细胞所占的比例来进一步评估嗜碱性粒细胞的活化率。

1.2.3 CD45 CD45 是Ⅰ型跨膜糖蛋白，又称白细胞共同抗原。作为一种受体蛋白酪氨酸磷酸酶，可参与细胞膜的信号转导，同时作为有核血细胞表面的特异性标志物，仅表达于除成熟红细胞和血小板以外的所有有核血细胞表面，主要参与血细胞的发育、活化、衰老和凋亡，尤其对淋巴细胞的作用显著，故在淋巴细胞膜表面的表达密度较高，依次是单核细胞、粒细胞，且CD45 的表达量随细胞的成熟而增加［38-39］。笔者认为CD45 可辅助其他标志分子对嗜碱性粒细胞进行检测。

1.2.4 其他表面分子 CCR3 是一种趋化因子受体，主要参与炎症细胞的浸润。其主要表达于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及肥大细胞等细胞膜表面［40］。CD123 为白细胞介素3 受体的1 个亚单位，对白细胞介素3 有较高特异性，表达于嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞及肥大细胞表面［41］。CRTH2是1种化学诱导趋向性受体，在人体外周血中主要表达于Th2 细胞、嗜碱性粒细胞及嗜酸性粒细胞表面，其通过与前列腺素D2 结合介导炎症细胞浸润来参与过敏反应的发生［42］。

2 BAT

2.1 FCM 及微流体技术 FCM 是一种利用流式细胞仪进行快速细胞定量分析和细胞分选的技术，具有速度快、分析全面、可定性及定量分析、测量参数多、分选纯度高等特点［7］。

微流体技术是一种高精度处理小体积流体的技术，通常只需微升到纳升的标本量［43］。微流控免疫亲和细胞分离（microfluidic immunoaffinity cell separation）是一种特殊的细胞分离技术，即把可与目标细胞特异性结合的抗体固定在微流控芯片的表面，之后通过与细胞结合来捕获细胞，再进行光学检测，对分离得到的目标细胞进行进一步的研究。该技术曾被用于全血中淋巴细胞及中性粒细胞等白细胞的分离［44］。

2.2 基于FCM 的传统BAT 传统的BAT 是在FCM的基础上对嗜碱性粒细胞加以定性及定量分析的方法，其步骤为：每批标本都需通过设立阳性对照与阴性对照来进行检测，其中抗FcεRⅠ抗体为阳性对照，刺激缓冲液为阴性对照［26］。将20 μl刺激缓冲液加入至100 μl 肝素化血液中孵育10 min，孵育时温度控制在37℃；终止嗜碱性粒细胞脱颗粒通过置于冰箱冷却5 min 实现；之后加入被标记的相关检测抗体（如被PE标记的抗IgE抗体及被FITC标记的抗CD63 或者被PE 标记的CD203c 抗体及被FITC 标记的抗CD63抗体），并于室温下放置10 min，实现细胞与相应抗体的结合；最后用溶血素处理溶解红细胞，经离心洗涤后通过流式细胞仪实现对嗜碱性粒细胞活化程度的定性和定量分析［45］。嗜碱性粒细胞活化程度用嗜碱性粒细胞活化率（即活化的嗜碱性粒细胞数与总嗜碱性粒细胞数的比值）来表示，通常活化率≥2% 可认为嗜碱性粒细胞活化。但当考虑到非特异性激活的因素时，活化率≥5% 考虑嗜碱性粒细胞活化［14，46］。国外也有学者提出用刺激指数（stimulation index，SI，即由过敏原激活的嗜碱性粒细胞百分比/自发激活的嗜碱性粒细胞百分比）来表示检测结果，然而目前关于SI 的公认标准尚未确定，需要有待进一步的研究［47］。

基于FCM 的传统BAT 存在耗时长、成本高以及对操作技术要求高等缺点，限制了其在临床工作中的普及，目前国内很多医院尚未开展BAT，故亟需改良传统BAT来满足临床需求。

2.3 基于微流体技术的新型BAT（miBAT） 在临床需求的推动下，近年来瑞典有学者提出了miBAT，国内尚未有关于miBAT 的文献资料报道。其具体方法步骤为：第一步制备微流控芯片器件并进行表面改性：①使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）平版印刷技术制备微流控器件；②经氧等离子体的短暂处理将PDMS 复制品粘在玻璃载玻片（70 mm×30 mm）上；③用3-巯基丙基三甲氧基硅烷（3-mercaptopropyl trimethoxysilane）处理芯片1 h为后续的固定捕获嗜碱性粒细胞的抗体（即抗CD203c生物素）做准备；④用乙醇洗涤后，与0.01 μmol/ml 4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（4-maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester，GMBS）在乙醇中室温孵育20 min；⑤先后用乙醇及磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤后，加入10 μg/ml 中和素溶液并于PBS 中在4℃下孵育过夜；⑥于实验前，注入生物素化抗CD203c 并孵育60 min，完成捕获抗体的固定，为后续捕捉嗜碱性粒细胞做准备。第二步微流控芯片中嗜碱性粒细胞的捕获：①在PBS 中用1% 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）以20 μl/min 的速度洗涤和封闭芯片，以去除未结合（抗CD203c 生物素）抗体；②200 μl 的全血以3 μl/min 的速度流过，然后用1%BSA 以20 μl/min 的速度将非嗜碱性粒细胞洗涤出去。第三步被捕获嗜碱性粒细胞的过敏原激发：①每组均需设立阳性和阴性对照，其中抗FcεRⅠ抗体作为阳性对照，刺激缓冲液作为阴性对照。分别用相关过敏原、阳性及阴性对照液刺激被捕获的嗜碱性粒细胞25 min；②用1%BSA 洗涤后，用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）在室温下固定10 min，然后清洗芯片；③用抗CD203c 抗体在室温下孵育1 h，再用荧光结合Alexa-488 的二级抗鼠抗体在室温下染色1 h；用Alexa-647结合的抗CD63抗体在室温下孵育30 min 后检测CD63 的活化，并用霍氏染色检测细胞核；④用1%BSA 清洗芯片，Nikon-Ti-Eclipse 显微镜扫描，Zyla 5.5scmos 相机采集图像，用MicroManager 1.4 版软件传输，Image J 软件插件处理。第四步微流控芯片中CD63 平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）的测量：荧光强度测量是用Image J软件直接在细胞上的多个点进行。图像的深底为背景测量。荧光强度测量用背景测量和目标测量的数值差表示。嗜碱性粒细胞的活化程度可以用嗜碱性粒细胞的MFI 比率（即活化嗜碱性粒细胞的MFI/非活化嗜碱性粒细胞的MFI表示）［8］。

目前国外学者提出可以通过预制芯片及用抗体涂层芯片，优化流速和孵育程序来缩短试验时间，利用计算机软件自动读取和分析图像，并对非活化细胞和活化细胞进行自动识别，来进一步优化该试验［8］。

miBAT 无需预先标记和处理样品，可直接从全血中捕获CD203c 阳性细胞（即嗜碱性粒细胞），并将捕捉到的嗜碱性粒细胞用抗FcRⅠ抗体激活，于荧光显微镜下检测嗜碱性粒细胞CD63 的表达水平。微流体技术的引入成功的解决了基于FCM 的传统BAT 存在的局限，不仅在降低成本的同时减少了对试剂量和生物样本量的需求，而且可实现高通量自动化分析以及将多个操作步骤集成在一个设备的目标，使得操作更简便高效。

2.4 BAT 的常见门控策略 BAT 的核心在于对样本进行处理后筛选符合要求的嗜碱性粒细胞。下面介绍几种常见的筛选门控策略：①IgE、CD63联合设门。第一步通过前向角与侧向角确定出嗜碱性粒细胞所在的大致区域，即白细胞群的区域；第二步根据嗜碱性粒细胞表面的IgE 受体可与IgE 特异性结合的特点，利用IgE-FITC 对其进行标记，筛选嗜碱性粒细胞；第三步根据嗜碱性粒细胞被激活后细胞膜表面有CD63 表达的特点，利用CD63 设门对处于活化状态的嗜碱性粒细胞进行筛选，并由此计算嗜碱性粒细胞的活化率［48］。然而由于IgE 可能会非特异地与单核细胞、B 细胞等黏附，因此可能使嗜碱性粒细胞活化率略低。故笔者认为在第一步操作时利用前向角与侧向角来确定粒细胞群的区域可在一定程度上减少IgE 非特异性黏附带来的误差，但有待进一步实验来验证；②IgE、CD45、CD63联合设门。第一步根据嗜碱性粒细胞表面表达有高亲和性的IgE 受体及CD45 的特点利用FCM 筛选出嗜碱性粒细胞，第二步根据嗜碱性粒细胞被激活后细胞膜表面表达CD63 的特点，利用CD63 设门将活化的嗜碱性粒细胞筛选出来，并由此计算出嗜碱性粒细胞活化率［34］；③IgE、CD45、CD203c 联合设门。第一步同②设门思路，第二步根据嗜碱性粒细胞被激活后高表达CD203c 的特点，利用CD203c 设门筛选出表达量明显上调的细胞即活化嗜碱性粒细胞，并计算嗜碱性粒细胞活化率［34］；④CRTH2、CD4、CD63联合设门。第一步利用CRTH2和SSC双参数设门选取CRTH2阳性细胞；第二步根据嗜碱性粒细胞表面CRTH2 阳性且CD4 阴性的特点，利用CD4 联合CRTH2 设门对嗜碱性粒细胞进行筛选；第三步在上述筛选结果的基础上利用CD63 设门将活化的嗜碱性粒细胞筛选出来，并计算出嗜碱性粒细胞活化率［49］；⑤CD123、HLA-DR、CD63 联合设门。第一步根据嗜碱性粒细胞表面CD123 阳性且HLADR阴性的特点，利用CD123和HLA-DR设门筛选嗜碱粒细胞，第二步在上述操作的基础上利用CD63设门筛选出活化的嗜碱粒细胞，并计算出嗜碱性粒细胞活化率［50-51］。但由于CD123 并不是特异性存在于嗜碱性粒细胞表面，也表达于血液中的中性粒细胞等细胞表面，故该设门法存在一定局限，可能会使得到的活化率偏低；⑥CD45、CD63、CD203c 联合设门［26］。根据嗜碱性粒细胞表面表达有CD203c 及CD45 的特点，第一步利用CD45 和SSC 双参筛选出CD45 阳性的细胞即有核细胞，第二步利用CD203c和SSC双参数筛选出CD203c阳性的细胞，第三步在上述筛选基础上再次通过CD45 和SSC 回选，确定CD203c 和CD45 双阳性的细胞，即为纯的嗜碱性粒细胞；第四步根据嗜碱性粒细胞活化后表面高表达有CD63 及CD203c 的特点，通过CD63 联合CD203c筛选出活化的嗜碱性粒细胞，并计算嗜碱性粒细胞活化率。

综上所述，笔者认为上述⑥的设门思路是一种最优的设门思路［26，52］。国内有相关研究便是采用该设门思路，如徐翀等［26］研究户尘螨过敏性疾病时便是采用该设门思路，并将试验结果与血清sIgE 及SPT 的结果对比，发现该设门思路的BAT 较sIgE 法而言在敏感度、假阴性率及阳性预测值方面均占有优势。再如刘欣跃等［52］采用该设门思路的BAT 研究诊断药物过敏时得出相同的结论，进一步证实该设门思路的可行性。该设门思路的优势具体表现为：一方面利用CD203c 联合CD45 对嗜碱性粒细胞进行分离较IgE 设门法而言效果更好，很好地避免了IgE非特异地黏附于血液中的单核细胞、B细胞等导致的误差；另一方面利用CD63 和CD203 联合设门对活化的嗜碱性粒细胞进行筛选可有效提高筛选的精确性。然而实践工作中有待对不同设门思路进行对照研究来进一步对BAT的设门进行规范。

3 BAT在过敏性疾病诊断中的应用

BAT 作为一种安全高效的辅助诊断过敏性疾病的方法，已被学术界广泛认可。国外已有关于BAT 用于诊断花粉、屋尘螨、药物、食物等过敏反应的报道。有学者研究发现CD203c 不仅在诊断人体对昆虫毒液过敏时的敏感性高，而且与进行毒液脱敏治疗时副作用的发生风险相关［53］。因此可通过检测CD203c 的表达来评估毒液脱敏治疗过程中副作用的发生风险。此外有研究报道哮喘患儿嗜碱性粒细胞CD63、CD203c 水平虽与病情的严重程度无关，但与患儿的哮喘急性发作次数呈正相关，即随着CD63、CD203c 的表达量上调，其发病次数增多［54］。因此可通过检测哮喘患儿治疗前后嗜碱性粒细胞表面CD63、CD203c 的表达水平来评估哮喘的治疗效果，及时采取措施预防哮喘的急性发生。由此可见BAT 不仅可用于辅助诊断过敏性疾病，而且还可以通过评估嗜碱性粒细胞的过敏原阈值来监测免疫治疗过程中副反应发生的风险，指导临床的预防工作。

关于药物诱导的过敏反应，有学者通过研究药物诱发的急性间质性肾炎（acute interstitial nephritis，AIN），认为BAT 可用于辅助诊断药物超敏反应引起的AIN，且认为当嗜碱性粒细胞的激活率＞5% 且刺激指数＞2 时，便可得到临床证实［9］。因此BAT 有望成为临床工作中及时对药物过敏做出诊断的有效辅助工具。

此外国外学者对日光性荨麻疹的研究表明，嗜碱性粒细胞在血清光过敏原刺激下通过IgE 介导的途径发生活化，并提出BAT 有望成为检测血清光致敏原的新方法，但需要对更多的日光性荨麻疹患者进行研究［55］。可见BAT 在诊断不同过敏性疾病方面有广阔的应用空间，有待进一步探索。

4 BAT的局限与展望

4.1 BAT 的局限 目前虽有关于BAT 辅助过敏性疾病诊断的研究报道，但尚未建立公认的标准化检测方案。具体从以下4 点来阐明：①关于标本的保存条件、保存时间范围尚没有统一标准，关于不同保存条件对实验结果的影响以及最佳的保存条件仍需进一步研究；②关于样本的处理，全血法可能会有血清成分的干扰，嗜碱性粒细胞分离法可能会使体外激活而导致假阳性；③关于BAT 检测指标的选择标准仍需进一步探索，如何根据不同的条件选择合适的设门指标仍有待研究；④关于检测结果假阴性及假阳性的尚未有统一的处理标准。

4.2 BAT的展望 BAT较体内试验而言更安全、高效、特异，较体外试验如特异性IgE 检测而言避免了交叉反应的影响，更加特异、精确，再如较嗜碱性粒细胞组胺释放试验而言避免了组胺来源多样性的干扰，更具特异性、更易操作。BAT 弥补了目前过敏性疾病体内和体外试验室诊断方法的不足，有助于更加全面的认识过敏性疾病。综上所述，相信进一步标准化后的BAT 将因其安全有效的特点得到普及，成为未来IgE 介导的Ⅰ型超敏反应的首选诊断方法，为无数过敏性疾病患者带来福音。