巨噬细胞在血管生成中的作用①

王梓权 樊 平 周 杰 翁 杰 冯 波

（西南交通大学材料先进技术教育部重点实验室，材料科学与工程学院，成都610031）

1 引言

血管生成是组织修复的必要条件，其核心在于炎症反应。理想的组织修复过程是炎症初期破坏病原体、促使血管萌芽，随后组织再生，炎症消退，最后恢复正常组织结构。但实际上，急性炎症在破坏有害物质同时也可能破坏正常细胞，导致组织或器官损伤；而慢性炎症会引起组织破坏和纤维化。巨噬细胞是炎症过程中极其重要的参与者，除机体免疫外，巨噬细胞在人体发育、动态平衡、血管生成、组织再生和植入体整合等方面也具有重要意义［1-2］。因此，基于巨噬细胞的组织修复治疗策略逐渐受到重视。

未受到极化刺激的巨噬细胞常被称为M0，而受到极化刺激的巨噬细胞通常被分为2 种表型：巨噬细胞受脂多糖（LPS）、IFN-γ 等炎症介质激活时表现为M1 型，又称经典活化型，在炎症反应中清除侵入病原体和异物，促进炎症发展；而巨噬细胞受IL-4、IL-10等因子刺激时表现为M2型，又称交替活化型，在机体中起抑制炎症反应、稳定血管生成和组织修复作用。

2 M0型巨噬细胞在血管生成中的作用

组织内常驻的巨噬细胞多为未极化的M0 型，是组织发育的关键参与者，对病原体的免疫反应、监测组织变化，尤其是维持组织稳态均具有重要作用［3］。

OLKOWSKI 等［4］采用3D 纳米纤维聚苯乙烯支架（NPSs）与M0 型巨噬细胞共培养，结果显示，巨噬细胞分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平上调，可通过募集内皮细胞发挥促血管化作用［5］。MOORE 等［6］将不同表型巨噬细胞与主动脉内皮细胞（AECs）包被在具有生物活性的聚乙二醇的水凝胶内，与单独的AECs 相比，M0 型巨噬细胞与AECs共同包被组的小管体积提高了2 倍，原因可能为水凝胶中AECs 与M0 型巨噬细胞直接接触。研究证明，巨噬细胞具有在体内和体外转分化为内皮细胞、内皮祖细胞或内皮样细胞的能力［7］。

总之，M0型巨噬细胞有助于血管生成和组织再生，但其促血管生成能力大多还是由极化后的表型实现。

3 M1型巨噬细胞在血管生成中的作用

M1 型巨噬细胞在血管生成中的作用具有一定争议。部分研究认为M1 型巨噬细胞在血管生成中具有不可或缺的作用。

GUREVICH 等［8］将原代人M1 或M2a 型巨噬细胞与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）共培养于一层成纤维细胞上，与其他组相比，M1型巨噬细胞诱导最长的总血管长度，原因为M1 型巨噬细胞分泌的VEGF水平显著上调。HSIEH等［9］采用外源注入M1型巨噬细胞的方法治疗小鼠缺血性肌肉损伤，结果发现在损伤早期（1～3 d）进行M1 治疗能改善血管生成，促进骨骼肌再生。

BEYER 等［10］设计了一种体外模型，将内皮细胞和周细胞以15∶1 掺入胶原蛋白Ⅰ凝胶球中并诱导发芽，将上述凝胶球暴露于不同表型巨噬细胞培养基，结果表明，M1 型巨噬细胞诱导内皮细胞和周细胞的迁移。结合相关研究，可能与VEGF 和IL-1b 共同作用有关［5，11］。KANG 等［12］研究表明，M1 型巨噬细胞分泌的TNF-α 既具有促血管生成又有抗血管生成作用，取决于剂量以及是否存在周细胞。无周细胞存在时，TNF-α 浓度越高，抗血管生成作用越强；有周细胞存在时，可改善高浓度TNF-α 引起的抗血管生成作用。

相反，也有研究认为M1 型巨噬细胞不会促进血管生成，甚至抑制血管生成。LIU 等［13］研究发现，心肌梗死后，M1型巨噬细胞释放出大量促炎外泌体（M1-Exos），抗血管生成并加速心肌细胞损伤。M1型巨噬细胞还表达高水平的促炎miRNA，如miR-155。miR-155 通过抑制内皮细胞迁移和增殖抑制血管形成。XU 等［14］采用褪黑激素将激光诱导的小鼠脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）中的巨噬细胞从M2 型极化为M1 型，这种表型转变显著降低CNV病变体积和血管增殖能力。

因此，M1型巨噬细胞在血管生成中的作用存在争议，可能有以下原因：①研究者选择不同种属细胞作为研究对象，已有研究表明不同来源巨噬细胞差异显著［15］；②不同损伤部位炎症环境存在差异，如糖尿病大鼠伤口溃疡往往较为严重，M1型巨噬细胞阶段持续时间过长，抑制血管生成，因此需尽快将炎症环境转为M2 阶段，促进血管生成和组织再生［16］，相反，小鼠缺血性肌肉损伤修复中需要丰富的新生血管，也就需要M1 型巨噬细胞激发血管萌芽［9］；③促炎因子存在时间，如SAINSON 等［17］采用含TNF-α（10 ng/ml）的培养基预处理包被有内皮细胞的纤维蛋白凝胶微球，2 d后将含TNF-α的培养基更换为基础培养基，结果显示经TNF-α 预处理组萌发的芽数显著多于仅使用基础培养基的对照组，但如先使用基础培养基处理样品2 d后再换成含TNF-α的培养基，该组萌发芽数反而明显少于对照组；④M1型巨噬细胞与内皮细胞的接触方式。

4 M2型巨噬细胞在血管生成中的作用

M2型巨噬细胞可稳定血管生成，促进成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积［18-19］。M2 型巨噬细胞因不同刺激物还可分为以下几种亚型：由IL-4或IL-13诱导的M2a；由免疫复合物（immune complex，IC）和Toll 样受体（toll-like receptor，TLR）或IL-1R 激动剂诱导产生的M2b；由IL-10 和糖皮质激素诱导的M2c［20］。3种亚型在血管生成过程中起不同作用。

SPILLER 等［21］研究显示，M2a 型巨噬细胞表达高水平的基质金属蛋白酶-3 组织抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases-3，TIMP-3），可阻断VEGF 信号传导和TNF-α 释放。因此，M2a 型巨噬细胞可通过募集周细胞和调节M1 型巨噬细胞信号传导促进血管生成。另外，M2a 型巨噬细胞表达并分泌高水平血小板衍生生长因子-BB（PDGFBB）和碱性成纤维细胞生长因子-2（FGF-2），PDGFBB具有募集周细胞和间充质干细胞，稳定新生血管作用［22］。如果没有PDGF-BB，仅在VEGF 刺激下形成的血管是渗漏的，不成熟易于降解；而FGF-2 是一种非常有效的促血管生成有丝分裂原和生长因子。M2c 型巨噬细胞表达高水平的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和胎盘长因子（placental growth factor，PGF），MMP-9 具有刺激血管生成、重塑细胞外基质和趋化内皮细胞作用；PGF 则在M2c 诱导的血管生成中起驱动作用［21-22］。

YUE 等［23］将 心 脏 成 纤 维 细 胞（cardiac fibroblasts，CF）与不同亚型巨噬细胞共培养或与其条件培养基共培养，结果显示，M2b 巨噬细胞显著抑制CF 增殖和迁移，以及纤维化相关蛋白表达。而M2a的作用与之相反。体内实验中M2b 也显示出抗纤维化作用。研究显示，M2b 与M2a 和M2c 的区别还在于其保留了高水平炎症细胞因子，并伴有高水平IL-10和低水平IL-12表达［24］。尽管M2b型巨噬细胞产生大量炎症细胞因子和有毒分子，但其可减少脊髓损伤和心肌缺血/再灌注损伤，有助于损伤部位组织修复［25］。此外，M2b 型巨噬细胞可促进Th2 分化和体液抗体产生。

M2型巨噬细胞不同亚型间作用机制不尽相同，需要在今后研究中更加细化其亚型分类及功能。另外，M2型巨噬细胞促血管生成能力并不适用于所有情况，研究发现，将M2 型巨噬细胞注射至糖尿病db/db 小鼠全层切除皮肤伤口，与空白对照组（注射生理盐水）相比，M2 型巨噬细胞并不能改善小鼠血管再生和伤口闭合［26］。提示M1 型巨噬细胞在促血管生长中的重要地位，即新血管生长需要经历炎症初期M1 阶段再转变到M2 阶段。过长的M2 阶段会导致过度纤维化从而损伤机体，在未来研究中应当关注如何使M2阶段适时结束。

5 由M1 到M2 的顺序激活在血管生成中的必要性

自然发生的炎症过程就是由促炎型M1 阶段适时转入愈合型M2 阶段，体外研究也证明顺序激活M1和M2的必要性。

SPILLER等［21］采用不同表型巨噬细胞的条件培养基培养HUVEC，观察血管化情况，结果表明，HUVEC 在M1 条件培养基中形成松散互连的血管簇，但在由其他表型（M0、M2a 或M2c）或所有3 种表型组合（M1、M2a 和M2c）的条件培养基中并没有这种现象。当条件培养基在24 h 从M1 型转换为M2a时，血管化类似于体内自然转变，成管行为明显增强。当条件培养基在24 h 由M1 转变成M2c 或基础培养基时，未观察到这种现象。因此，仅当初期存在M1型巨噬细胞及其释放的炎症信号时，M2a型巨噬细胞才能分泌一些引起发芽血管融合的信号（如PDGF-BB等），从而增强成管行为。

CHEN 等［27］对纯钛表面进行纳米化表面改性，得到二氧化钛纳米管（TNTs）阵列，将抑炎因子IL-4吸附到TNTs后，在其上制备京尼平交联的羧甲基壳聚糖凝胶，再加载促炎因子IFN-γ，最后覆盖一层β-甘油磷酸钠交联的壳聚糖凝胶。这种携载双重炎症因子的材料体系被用于研究材料引发的初期炎症响应和后期调控。结果表明，随着凝胶层降解，首先是IFN-γ 明显释放，形成的炎症环境将巨噬细胞极化为M1 表型；随后以IL-4 释放为主，导致M1型巨噬细胞大量极化为M2 型，将促炎阶段转变为促愈合阶段。YIN 等［28］在装载IL-4 的TNTs 上组装海藻酸钠/壳聚糖的聚电解质多层膜（PEM），再结合京尼平/氯化钙交联剂以调节IL-4 释放。该材料体系在仿生条件下前3 d 缓慢释放少量IL-4，3 d 后释放量快速增加。当材料与巨噬细胞共培养时，采用促炎因子刺激的巨噬细胞在前3 d 保持M1 型，高表达促血管出芽的TNF-α、IL-1β 和VEGF；而7 d 时已转化为以M2 表型为主，并高表达促血管网络化的PDGF-BB。

以上植入材料设计表明，可通过阶段性控释炎症因子，调节巨噬细胞表型由M1 到M2 的顺序激活，促进新血管生长，进而实现组织再生。

6 巨噬细胞与其他细胞相互作用

血管生成和组织再生是通过巨噬细胞与其他细胞相互作用实现的。内皮细胞是血管生成过程中的必需细胞，因为血管生成是通过内皮细胞迁移、增殖、排列、分支和吻合等行为实现的。巨噬细胞可通过作用于内皮细胞实现促进血管生成的作用。反之，内皮细胞对巨噬细胞也有所影响。

HE 等［29］研究中，肝窦内皮细胞（IMEC）与造血细胞（hematopoietic cells，HCs）直接共培养可使HCs分化为巨噬细胞并产生集落，集落外围的巨噬细胞向M2型极化。当2种细胞间接共培养时，集落消失且无极化现象。体内实验表明，被IMEC 极化的巨噬细胞促进小鼠体内肿瘤血管生长。JETTEN 等［22］研究发现，尽管M1 型巨噬细胞的条件培养基具有血管生成潜力，但当其与内皮细胞直接共培养时，血管形成受到抑制。表明内皮细胞和这些巨噬细胞直接接触抑制血管形成并抑制巨噬细胞产生促血管生成因子。MOORE 等［30］采用聚乙二醇水凝胶包被内皮细胞和巨噬细胞，发现内皮细胞可改变巨噬细胞形态。内皮细胞与巨噬细胞有2种直接接触模式，分别为：巨噬细胞与内皮细胞小管外壁紧密结合；巨噬细胞桥接内皮尖细胞并作为支持细胞。但有关巨噬细胞与内皮细胞的膜结合因子及其对血管生长的影响机制尚未阐明。

血管生成过程中，巨噬细胞除与内皮细胞相互作用外，还与间充质干细胞、成纤维细胞等相互作用。JUKKA 等［31］研究表明，间充质干细胞可募集巨噬细胞，并使其向M2 表型极化；巨噬细胞对间充质干细胞具有募集、增殖和分化作用。JULIE 等［19］和MIKLOS 等［32］研究显示，M2 型巨噬细胞可促进成纤维细胞趋化、增殖和分化；反之，成纤维细胞也会募集巨噬细胞。

LI 等［11］设计了一种将IFN-γ 加载于5%硅酸钙/β-磷酸三钙（CaSiO3-β-TCP）的支架。早期释放IFN-γ 以刺激巨噬细胞向M1 型极化，随后释放Si 诱导巨噬细胞向M2 型极化。将原代人骨髓源性单核细胞（hBMMs）与几种支架共培养，包括β-TCP、IFN-γβ-TCP、CaSiO3-β-TCP 或IFN-γ-CaSiO3-β-TCP。分别收集其上清作为条件培养基培养HUVEC，用作体外血管形成试验。另以CaSiO3-β-TCP 浸提液用于血管形成实验，以区别硅酸盐对HUVEC 的直接作用，结果表明IFN-γ-CaSiO3-β-TCP 与hBMMs 条件培养基用于HUVEC 培养时，具有最好的血管生成效果。同时仅材料本身的浸提液也可促进HUVEC 血管生成。

CHEN等［33］将聚己内酯（PCL）/F-127通过3D打印技术制备成纳米纤维网，该纳米纤维网和骨髓间充质干细胞（BMSCs）组成一种新型支架。 载有BMSCs的3D支架可促进肉芽组织形成，促进血管生成并促进胶原蛋白沉积。且该支架抑制巨噬细胞向M1 型极化并促进其向M2 型极化。间充质干细胞因其可分化性多用于骨修复。

血管生成和组织再生过程是一个多细胞参与的复杂生理过程，进行组织修复时，如果仅考虑巨噬细胞或巨噬细胞对其他细胞的单向作用，可能不易起到良好的治疗效果，需综合考察此过程中巨噬细胞与其他细胞的相互作用，有望更好地解决组织再生与修复中的难题。

7 结论和展望

综上所述，巨噬细胞无论是以何种表型存在（包括M0、M1 和M2），均对血管生成和组织再生起重要作用，且3种表型的作用并不是孤立的，而是相互联系的。组织修复过程中，巨噬细胞是极为重要的角色，但其他细胞，如内皮细胞、成纤维细胞和间充质干细胞，也是不可或缺的，其与巨噬细胞相互作用，共同达到促血管生成，进而促组织再生的目的。虽然目前对巨噬细胞在血管生成中的作用有了一定认识，但无论在理论上还是临床应用中均还存在亟待解决的问题，如炎症微环境变化与巨噬细胞表型转换的联系及其对血管生成的作用，巨噬细胞不同表型存在时长对血管生成的影响，巨噬细胞与其他细胞相互作用过程的生化反应、信号通路及其传递机制，内源巨噬细胞募集效率，外源巨噬细胞递送方式和时间点，生物植入材料设计方案，老年患者组织修复中的血管生成，血管生成中的性别差异等。

巨噬细胞在血管生成中的作用是涉及多细胞、多蛋白、多生物因子及可变生理微环境的多因素协同过程。通过组织学、细胞学和分子生物学等多层面实验与理论研究才能充分认识其作用机制的科学基础，并指导临床实践，更好服务于患者，造福社会。