利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠CCKAR敲除载体

刘惊涛，李知宗，林显光，陈恒玲

(中南民族大学 生物医学工程学院/脑认知国家民委重点实验室/医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室，武汉 430074)

1 胆囊收缩素A受体与CRISPR/Cas9系统工作原理

1.1 胆囊收缩素A受体

胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)由肠I细胞分泌，CCK可通过内分泌、旁分泌、自分泌和神经分泌等多种形式调节多种细胞功能[1]。研究提示，CCK可能与糖尿病的发病存在密切关系[1]。在胰岛中，CCK可以通过胆囊收缩素A受体(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)来调控胰腺中各个细胞的功能。大量事实证明，CCKAR基因与动物的日采食量和平均日增重有明显关联。Takiguchi通过研究发现，CCKAR基因能维持动物体内的血糖浓度[2]。胆囊收缩素A型受体基因与幻听相关[3]，胆囊收缩素A型受体与人群胆道癌及胆石症易感性有一定关系[4]。

1.2 CRISPR/Cas9系统工作原理

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)被称为规律成簇间隔短回文重复序列。Cas9是CRISPR相关核酸酶，CRISPR/Cas9是最新出现的一种由gRNA指导的、利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA序列进行特异性降解。crRNA通过碱基互补配对，与tracrRNA结合，形成tracr/crRNA复合物。此复合物引导核酸酶Cas9蛋白与crRNA互补配对的序列靶位点剪切双链DNA。CRISPR/Cas9系统由于其突变效率高、制作简单、成本低，被广泛应用于基因组的精确修饰，是一种具有广阔应用前景的基因改造分子工具[5-7]。研究使用的载体为pL-CRISPR.EFS.GFP(载体信息见ADDGENE :57818)。

2 实验部分

2.1 实验材料

BsmbⅠ限制性核酸内切酶(美国Thermo Scientific公司生产)、CCKAR Oligo序列(武汉Tsingke公司生产)、T4 DNA连接酶(武汉淼灵生物公司生产)、pL-CRISPR.EFS.GFP(实验室提供)、5× Annealing buffer(上海Beyotime公司生产)、质粒提取试剂盒(美国OMEGA公司生产)、DH5α感受态细胞(武汉Tsingke公司生产)、PCR仪(美国Veriti公司生产)、抗生素(中国Bioshap公司生产)、电泳槽和电泳仪(美国Bio-rad公司生产)、凝胶成像系统(英国SYNGENE公司生产)、恒温摇床(美国Thermo Scientific公司生产)。

2.2 实验方法

2.2.1 pL-CRISPR.EFS.GFP质粒提取

按照OMEGA质粒提取试剂盒(D6950-01)中的提取方法进行pL-CRISPR.EFS.GFP质粒的提取。

2.2.2 设计oligo

使用CRISPR设计工具得到guide RNA，用软件根据碱基互补配对原理得到两条Oligo DNA。实验使用的CCKAR基因的单链Oligo DNA如表1。

表1 CCKAR基因的Oligo 序列

2.2.3 Oligo退火

将设计好的CCKAR基因的两条Oligo按照表2的退火体系进行退火，退火条件为95℃，10 min；95℃～45℃，每2 min降1℃；45℃～16℃，每1 min降1℃。退火之后形成双链Oligo。将退火后的产物用水按照1∶100进行稀释备用。

表2 退火体系

2.2.4 pL-CRISPR.EFS.GFP单酶切

将提取好的质粒测浓度及纯度，根据浓度，按表3进行酶切，37℃，30 min。

表3 单酶切体系

2.2.5 回收

将酶切好的质粒按OMEGA胶回收试剂盒(D2500-02)中的步骤进行回收。

2.2.6 连接

将稀释好的双链Oligo产物与回收好的空载体按表4进行连接，25℃连接2 h。

表4 连接体系

2.2.7 转化

提前准备好冰盒，从-80℃取出DH5α感受态细胞，置于冰上解冻。将连接产物加入感受态细胞中(体积比不低于1∶10)，轻弹混匀，冰浴30 min。准备42℃水浴锅，将冰浴好的混合液置于其中热击90 s，向其中加入400 μL不含抗生素的LB培养基，混合均匀，置于37℃恒温摇床，180 r/min，45 min。将其放于离心机中离心，条件3 500 r/min，5 min。弃400 μL上清，将剩余100 μL吹打混匀。将菌液均匀涂布于含抗性的LB固体培养基上，37℃，倒置培养过夜。

2.2.8 挑选阳性克隆

准备好无菌50 mL离心管及含氨苄抗性的液体LB培养基及含单菌落的平板。取5 mL培养基加入离心管中，从板子上选取几个单菌落，用无菌的小枪头挑取单菌落置于离心管中。

2.2.9 摇菌

标号，置于摇床中，摇至菌液浑浊。

2.2.10 阳性克隆鉴定

鉴定阳性克隆所用的引物如表5所示。将浑浊的菌液按表6体系及表7的反应程序做菌液PCR鉴定。

表5 菌液PCR体系

表6 菌液PCR体系

表7 PCR反应程序

a2～4重复进行，共36个循环，每4个循环降低2℃，退火温度将从68℃将至52℃

将鉴定正确的菌液送测序。

3 结果

3.1 空载体单酶切凝胶成像结果

提取的空载体浓度为540 ng/μL、A260/280为1.85，按照表3单酶切体系进行酶切，酶切产物进行电泳，结果如图1所示，回收所需片段。

图1 M：1000 Marker，1：pl-CRISPR.EFS.GFP单酶切电泳结果

3.2 菌液PCR凝胶成像结果

将挑取的单菌落菌液进行Touchdown PCR，结果如图2所示，菌液PCR可见大小约300 bp条带，初步判断：挑取的五个菌落均为阳性克隆。

图2 M：2000marker；1-5：pL-CRISPR.EFS.GFP-CCKAR不同克隆的PCR结果

3.3 公司测序结果

将菌液PCR结果正确的菌液送至武汉擎科生物技术有限公司进行测序，结果显示：靶序列成功插入到pL-CRISPR.EFS.GFP(图3、4红色框起来的部分)。

图3 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR测序图

由公司给出的测序结果可知，检测KO载体的阳性克隆结果是准确的。

图4 pL-CRISPER.EFS.GFP-CCKAR测序峰图

4 讨论

CCKAR是一种G蛋白偶联受体，可以被CCK激活。肥胖是2型糖尿病的主要诱发因素，CCK通过CCKAR的介导对中枢系统的摄食、饱感具有调节作用[9]。CCKAR基因的功能丧失可能在肥胖小鼠中诱发糖尿病。研究发现，具有 Otsuka Long-Evans Tokushima fatty(OLETF)的大鼠是天生的CCKAR基因敲除型大鼠，而OLETF的特征就是高血糖症、高胰岛素血症和肥胖[1]。理解不同CCKAR激活的上游及下游信号通路调控胰腺细胞的其他性能，可用于识别有偏好的CCKAR配体，为以后开发新的抗糖尿病药物提供帮助。

基于Crispr/cas 9系统的特殊性，即插入片段在20 bp左右，目的片段PCR扩增鉴定阳性克隆并不可行。在此实验鉴定中，设计正向引物位于BsmB I酶切位点的上游300 bp处、反向引物是构建载体的Oligo 2，当为阳性克隆时，可以扩增一个约300 bp的带，当为阴性克隆时无法扩增。利用此技术，成功构建了CCKAR基因的敲除载体，相比于传统构建载体方法更省时省力。

在基因工程中，基因表达载体的构建是一个非常重要的实验步骤。实验可以通过载体将靶序列转运到真核细胞中并将细胞基因组中的靶序列进行基因编辑，用到的载体含有GFP标签，将构建好的载体转染到细胞中，其是否表达可很明显地看出。新构建的KO载体可以方便后续验证设计出的sgRNA的活性及是否脱靶，如果将其包装成慢病毒非常适合常规细胞系的建立。