茎用莴苣肉质茎内绿色组织光合特性探析

2021-03-29朱俊杰王天顺牙禹廖洁闫飞燕

中国蔬菜 2021年3期

朱俊杰王天顺牙禹廖洁闫飞燕

（1 广西大学林学院，广西南宁 530004；2 广西壮族自治区农业科学院农产品质量安全与检测技术研究所，广西南宁 530007）

茎用莴苣（Lactuca sativaL.var.asparaginaBailey）是菊科莴苣属植物，营一年或二年生，别称莴笋、莴苣笋、香笋等（袁庆军和杨昌煦，2002）。食用时汁液浓郁、脆嫩可口，可生食、凉拌、炒食、干制或腌渍，含有丰富的蛋白质、脂类物质、碳水化合物、维生素（如尼克酸）和矿质元素（如铁、锌）等各种营养成分（高天啟，2018），还具有良好的保健功效，对改善糖代谢、镇痛、刺激消化、分解亚硝胺等均有一定的作用（戴国辉等，2008）。茎用莴苣在我国各省（市）大面积种植，是响当当的大众蔬菜，蔬菜市场的“压舱石”。

在北方地区，秋冬季低温是限制茎用莴苣生产的主要因素，大棚生产虽然可部分解决低温问题，但成本较高。南方地区尽管一年可以三季甚至四季生产茎用莴苣，但夏季高温也严重影响其产量和品质。总体看，茎用莴苣的单产和品质还有较大的提升空间。光合作用是植物生产的物质和能量源泉（South et al.，2019），茎用莴苣干物质绝大部分来自光合作用，产量提升和品质改良离不开对光合作用的系统和深入研究。目前茎用莴苣光合特性的研究已经有一些零星报道，但这些研究主要集中于施肥对茎用莴苣叶片光合气体交换特性的影响上（曾希柏，1997；李会合等，2004；王菲等，2016；张迎春等，2020），而茎用莴苣叶片叶绿素荧光特性研究方面还鲜有报道。

茎用莴苣的食用部分包含幼嫩叶片，但主要是肉质的茎内组织。与其他可食茎蔬菜如洋葱、藕、慈姑、荸荠、马铃薯、大蒜、百合相比，茎用莴苣茎内含有更多的叶绿素，组织更为脆嫩，含水量更为丰富。茎瘤芥、抱子芥等蔬菜的茎内组织表层也分布有绿色组织，但其深入茎内的深度和持久度则无法和茎用莴苣相比，在老化之前，茎用莴苣茎内深层组织叶绿素含量比表层组织更多。在植物学上，非叶片绿色组织，如茎秆、叶柄等的光合能力和机制近年来受到关注，这些组织的光合特性和叶片有明显差别（Xu et al.，1997；张永平等，2011；张金尧等，2014）。本试验的第一个目的是以叶片为对照，对比监测分析茎内深层组织的光合特性，揭示其光合能力和可能机制。根据植物生理知识，绿色组织中叶绿素的形成和维持需要持续不断的光环境（史典义等，2009），而成熟的茎用莴苣茎内深层组织一直是无光环境，这似乎与生理理论相悖。细胞分裂素具有保绿功能（王三根，2000），是否与茎用莴苣茎内绿色组织存在关联？对茎用莴苣品质有怎样的影响？这是本试验要回答的第二个问题。这两个问题的探索，将为植物光合作用理论研究及茎用莴苣产量和品质改良提供新视角。

1 材料与方法

1.1 材料

将30 g 市售茎用莴苣品种四季大尖叶（桂林市桂华种子有限责任公司）种子平均分成3 份，于2019 年8月2 日播种于广西大学试验基地，播种地块平均分成3 份，每份3 m2。出苗后按尿素225 kg·hm-2、硝酸钾300 kg·hm-2追肥1 次，常规管理，生长至11 月30 日收获。

1.2 方法

1.2.1 叶片和茎内组织叶绿素荧光特性的测定在上述样地每个地块中选取无明显虫害、长势中等的茎用莴苣3 株，共9 株，收获当日每样株选取茎秆中上部健康成熟的6～8 片叶，在凌晨天亮前3：00—5：00 用调制叶绿素荧光成像系统IMAGIN G-PAM MINI-版（德国walz 公司）中的测量光测定基底荧光Fo，再打开饱和闪光监测最大荧光Fm 值，根据两参数自动获得Fv/Fm。然后再换一个部位测定吸光系数Abs，用于后续相对电子传递速率的计算。数据保存后开启250 μmol·m-2·s-1活化蓝光进行叶绿素荧光慢速动力学曲线诱导4.5 min，记录稳态荧光值（Ft）、非光化学能量耗散效率（qN）、光化学能量耗散效率（qP）、相对电子传递速率（ETR）、光化学能量耗散Y（Ⅱ）、非光化学耗散Y（NPQ）和组成型能量耗散Y（NO）等荧光参数值。最后开启相对电子传递速率（ETR）和热耗散速率（NPQ）的光响应曲线测定，设1 500、1 000、800、400、300、200、130、70、40、20、0 μmol·m-2·s-1共11 个光照强度（PPFD）梯度，每梯度持续时间为3 min。

叶片荧光参数值测定完成后，将茎用莴苣样株砍收，带回实验室用清水冲洗3 遍，用毛边纸吸干多余水分，再将中上部叶片标记后收集起来供后续其他指标测定。最后将9 株样株茎秆从底部向上纵向剖开，在剖面上根据绿色的深浅和茎秆实际所处部位，分为上、中、下3 段，每段分别按上述方法测定纵向剖面组织的各项叶绿素荧光参数值，另外再取少量样株，在茎段相应部位横切，按上述方法测定横切面各项叶绿素荧光参数值，以验证纵切面所获结果的可靠性（图1）。

1.2.2 叶片和茎内组织含水量的测定从上述9 株样株上每株分别随机抽取3 片标记叶片，9 片一组，去头去尾后取中段，称取并记录鲜质量，随后放入3 个不锈钢盒，转入烘箱，在120 ℃杀青1 h，然后转入牛皮纸信封烘至恒重，再根据鲜质量和烘干后干质量差计算含水量（%）。茎段内组织含水量测定和叶片类似，不同的是从茎内组织切取小段茎，称取鲜质量后需切成薄片，然后再杀青、烘干。

1.2.3 叶片和茎内组织叶绿素含量的测定从上述9 株样株上每株取3 片叶，9 片一组剪碎混匀后称取1.0 g。茎内绿色组织取样时3 株一组，按图1 标注，分部位切出小段茎块，每组中每部位各称取1.0 g，然后在黑暗冰浴条件下，用80%的冷丙酮研磨成匀浆，再经双重滤纸过滤至50 mL 容量瓶定容，最后在分光光度计（日本，岛津UV1001）上读取645 nm 和663 nm 下的光吸收值，根据下述公式计算叶绿素含量（Lichtenthaler &Wellbum，1983）。

其中，Vs是定容后的体积，W是组织质量。

1.2.4 叶片和茎内组织玉米素含量的测定分别用上述方法，从剩余的叶片和茎内组织各取样1 g，先用5 mL 80%冷甲醇匀浆，匀浆液转入冷藏管，加入15 mL 冷甲醇密封后于4 ℃冰箱中过夜。第2 天取出密封液，转入离心管，4 ℃下6 000 r·min-1离心10 min，沉淀用少量80%冷甲醇浸提后再离心1 次，合并上清液减压蒸发至2 mL 左右。浓缩液经0.22 μm 的微孔滤膜过滤，使用高效液相色谱仪（美国，Waters 公司）检测。色谱条件为：Surfire 150 mm × 4.6 mm C18反相色谱柱；流动相A 为100%色谱级甲醇，流动相B 为纯化过滤的0.077%冰乙酸水溶液；梯度洗脱，0～7 min 30%～50% A，7～14 min 50%～55% A，14～16 min 55% A，16～28 min 50% A，流速1 mL·min-1，进样量15 μL，检测波长254 nm。玉米素标样从Sigma 公司购买。

2 结果与分析

2.1 叶片和茎内组织叶绿素荧光值状况分析

从凌晨最大光化学效率Fv/Fm 值看，茎用莴苣叶片光合机构运转良好，没有明显的逆境胁迫（图2）。尤其是上段和中段茎内一直处于黑暗条件下的绿色组织Fv/Fm 值也高达0.75 以上，虽然数值和叶片有显著差异，然而这个结果已经和很多光下健康的高等植物叶片的表现接近。下段茎内绿色组织Fv/Fm 值则比叶片小了将近1 倍（图2），可能是组织更老化，叶绿素含量降低的结果，但对于一直处于黑暗条件下的组织来说，这个Fv/Fm 值也很高。从Fo 值看，中上段茎内组织还略高于叶片，下段茎内组织则下降了近一半。这些结果表明，茎内深处绿色组织是有光合潜能的。

图3 显示的是茎用莴苣不同组织从黑暗条件经250 μmol·m-2·s-1光化光诱导后能量分配的情况。叶片中主要光能用于光化学反应Y（Ⅱ）消耗；热耗散Y（NPQ）消耗的能量占比相对较低，且和其他茎段内组织差别不大。而茎的内部组织中，上段茎内组织吸收的光能有31%通过Y（Ⅱ）途径消耗；中段茎内组织Y（Ⅱ）耗能比例明显高于上段茎内组织；下段茎内组织Y（Ⅱ）耗能比例远低于其他组织，而组成型Y（NO）能量耗散比例则明显高于其他组织。

表1 显示了茎用莴苣叶片和茎内组织从暗处经光诱导后主要叶绿素荧光参数值的变化状况，总体看，叶片中稳态荧光值（Ft）、非光化学能量耗散效率（qN）、光化学能量耗散效率（qP）和相对电子传递速率（ETR）等参数值都显著高于茎内组织，茎内组织中以中段组织表现较好，除qP 和上段茎内组织差异不显著外，其他参数值均显著高于上段和下段茎内组织，下段茎内组织的所有参数值都显著低于上段和中段组织。

从ETR 的光响应曲线看，各光强梯度下叶片ETR 值明显强于各茎内组织（图4-A），茎内组织间以中段稍高于上段，上段又强于下段。这个结果一方面反映了叶片是主要光合器官的事实，另一方面也预示茎内绿色组织有一定光合潜能。NPQ 也是植物组织消耗多余光能的重要途径，茎用莴苣各组织NPQ 值均随着光强的增加而呈直线上升，叶片比茎内组织上升得更快更明显，茎内组织中也是以中段表现最佳，下段最弱（图4-B）。

表1 茎用莴苣不同组织从暗处经光诱导后主要叶绿素荧光动力学曲线参数值

2.2 茎用莴苣叶片和茎内组织水分、叶绿素、玉米素含量及相关性分析

如图5-A 所示，叶片含水量虽然接近90%，但显著低于茎内组织。茎内组织含水量以中段最多，高达95.73%，上段次之，下段最少。多数蔬菜作物幼嫩器官含水量往往比成熟器官高，茎用莴苣也是如此。

从外观上看，叶片绿色要浅于茎内组织，但由于茎内组织含水量较高，从以鲜质量为基础的叶绿素含量实测值来看，叶片还是显著高于茎内组织（图5-A）。茎内组织中又以中段最高，显著高于上段和下段，这和视觉效果是相符的。从叶绿素a 和叶绿素b 的比值看，叶片（3.14 ± 0.02）显著高于茎内组织（上段1.97 ± 0.01，中段2.12 ± 0.03，下段1.89 ± 0.02），说明茎内组织中叶绿素b的占比更高，这也是它看起来比叶片更绿的原因。

由图5-B 可知，叶片内玉米素含量显著低于茎内组织，茎内组织中，中段显著高于上段和下段，下段略低于上段，这个分布状况和含水量的分布是相似的。

仅仅从茎内组织看，叶绿素含量和含水量是显著的正相关关系，如果把叶片也考虑进来，则这种相关性就很弱了（图5-A）。叶绿素的卟啉环本身是一个亲水基团，可能在茎用莴苣茎内起到保水作用。与此类似，茎组织内玉米素含量和叶绿素含量也呈显著的正相关关系（图5-B）。同样，如果把叶片也纳入，则这种相关性几乎就没有了。

3 讨论

3.1 茎用莴苣茎内绿色组织的强劲光合潜力及原因分析

从茎用莴苣茎和叶片叶绿素荧光特性的对比看，黑暗中生长的茎用莴苣茎内组织具有很强的光合潜能（图2～4），至少有很强的光能转换和利用潜力，尤其是茎中段的绿色组织。叶绿素荧光参数Fv/Fm 值是反映植物潜在光化学效率的可靠指标（Demmig-Adams et al.，1996），同时也是反映植物耐受光抑制能力的重要参数（Che et al.，2020）。大量研究结果表明，高等健康绿色植物叶片经过一个夜晚的恢复后，其凌晨Fv/Fm 值通常在0.75 以上（Smillie et al.，1988）。本试验中茎用莴苣上段和中段茎内组织Fv/Fm 值在这一范围内，预示其较高的光化学效率。将茎用莴苣茎内组织从黑暗转到活化光下经过一段时间光诱导，叶绿素荧光发射量达到稳态后，监测光能分配利用的结果表明，上段和中段茎内组织通过光化学途径耗散的光能所占比例较大，进一步验证了其高效的光化学能力。叶绿体内囊体膜上的电子传递是植物将光能转换为化学能的核心环节，电子传递能力将直接决定光能的利用水平。从茎用莴苣茎内组织电子传递速率的表现看，尽管和叶片有差距，但其绝对值并不比其他植物叶片低，再次印证了茎内组织的光合潜能。

植物非叶片绿色组织的光合作用近些年来引起了研究者们极大的兴趣，他们对植物果皮（黄仁等，2019）、叶柄（胡文诗等，2019）、枝条和茎表皮（刘涛等，2019）等绿色组织的光合能力进行了一些探索性的研究，发现了一些特殊的光合机制。例如，Hibberd 和Quick（2002）在烟草中发现，与叶片的C3途径光合作用不同，茎和叶柄是C4途径的光合作用，其碳源来自微管组织而非气孔。和上述这些非叶片绿色组织不同，茎用莴苣的绿色组织深埋在茎内部，太阳光不可能到达，而中段和上段茎内组织光化学潜力（Fv/Fm）比下段组织还更高一些（图2）。光合作用整个过程大体分为光反应和碳反应两个阶段，两阶段均需要光的参与，而茎用莴苣茎内组织根本就没有获得光的机会。那么，茎用莴苣在长期的进化中为什么保留这种特性呢？在茎用莴苣的栽培管理过程中，笔者偶尔会发现少量茎秆破裂的植株，以及少量被昆虫或老鼠等小动物啃食后被风吹断的植株，对这些茎用莴苣植株来说，这时茎内绿色组织额外补充的光合产物有助于完成生活史。生产实践中，这些植株通常能继续顽强地生长，并从伤口附近长出新叶，这也许是一种进化生存策略。

3.2 茎内深层组织叶绿素长期维持的一种可能机制及作用

叶绿体是光合作用的结构基础，叶绿体中叶绿素的形成和维持需要一定的光照条件（史典义等，2009），而茎用莴苣茎内深层组织长期处于黑暗条件下，茎内组织的叶绿体是依靠什么机制长期在黑暗条件下维持一定的叶绿素含量呢？细胞分裂素是植物体内一种重要的天然激素，主要在根系合成，然后运送到细胞分裂和生长比较旺盛的组织中，细胞分裂素的主要功能除了促进细胞分裂和生长外，还有保幼和保绿的效应（王三根，2000）。对于茎用莴苣来说，其茎内肉质组织是生长和代谢最旺盛的部位，细胞分裂素有可能是一个重要因素，叶绿素含量的维持也可能与此有关。玉米素是高等植物内常见的一种内源细胞分裂素物质，其功能在多种植物中都得到验证（董学会等，2001；李志康等，2018；陈婷婷等，2019）。从茎用莴苣组织的测定结果看，茎内组织确实含有比叶片更高的玉米素，并且生长旺盛的中段茎含量最高，而且玉米素含量和叶绿素含量在茎内是一种正相关关系（图5），因此极有可能是细胞分裂素（这里是玉米素）在促进茎用莴苣组织细胞分裂和生长的同时维持细胞的幼嫩和绿色状态。然而茎用莴苣茎内这些绿色组织除了应对突发灾害（如茎秆破裂和折断）时可能提供额外光合产物外，是否还有其他功能？叶绿素的合成和维持是需要消耗一定碳水化合物的，目前认为叶绿素的主要生理功能是吸收光能并进行光物理和光化学反应。从分子结构看，叶绿素分子骨架含有一个大的卟啉环，这个卟啉环是亲水基团，可以在周围聚集大量水分子。本试验结果证实，茎用莴苣茎内组织叶绿素含量和含水量呈显著的正相关关系（图5）。在生产实践中也不难发现，越是生长旺盛充分的茎用莴苣茎内组织，其绿色也越深，含水量也越高，而随着茎内组织的老化，绿色组织逐渐失水变色并空心化；干旱条件下，茎用莴苣茎内组织绿色明显减弱，水分含量也减少，这也从侧面印证了上述机制。