小反刍兽疫疫苗研究进展

李 菊，和伟程，柏家林

(1.西北民族大学 生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

小反刍兽疫(Peste des Petits Ruminants,PPR)是小反刍兽疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus,PPRV)通过呼吸道和消化道感染引起的一种急性传染病，短时间内可侵袭所有重要器官[1].PPRV主要感染山羊和绵羊，导致极高的发病率和死亡率，中亚地区的濒危动物赛加羚羊也深受影响[2-3].根据PPRV 核衣壳(Nucleocapsid protein,N)蛋白和融合(Fusion protein,F)蛋白基因的部分序列，将其分为4个谱系，但发病早期病毒致病性没有谱系特异性差异[4].该病的潜伏期一般为4～6天，早期感染在局部淋巴组织中[5]，感染后5～10天传染性最强[6]，临床表现为发热、呼吸困难、白细胞减少及排泄物增多等，通过组织学检测可在病畜脾脏、淋巴结和胸腺中检测到糜烂性坏死.PPR的实验室确诊需通过病毒分离、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)和病毒中和试验(Virus neutralization test,VNT)三个金标准.在资源有限的环境下，侧流装置(Lateral-flow device,LFD)和逆转录重组聚合酶扩增(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,RT-RPA)检测技术可为检测PPRV提供一个简单、快速、可靠的检测平台.有人认为进行PPRV分子诊断时鼻拭子是首选标本[7-8].

PPRV 于1942年首次在西非的科特迪瓦被发现，曾在非洲、中东和亚洲等地区流行并造成重大经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)和联合国粮食及农业组织(FAO)列为未来15年必须消灭的跨界疫病.2007年在我国西藏首次爆发小反刍兽疫，2013—2014年间该病在我国22个省市流行开来[9-10]，2018年在我国甘肃西北部造成少量绵羊死亡[11]，由此PPRV疫苗的开发就显得十分重要.

1 病毒分子结构及流行病学

1.1 病毒分子结构

PPRV是15 948个核苷酸组成的无节段单股负链有包膜的RNA病毒，由3'N、P、M、F、H和L5' 6个转录单元组成.根据开放阅读框架和RNA编辑的不同，可编码8种蛋白质，包括核衣壳(N)蛋白、基质(Matrix protein,M)蛋白、聚合酶(Large virus-specified RNA polymereasprotien,L)或大蛋白、磷(Phospho protein,P)蛋白、血凝素(Hemagglutinin protein,H)和融合(F)蛋白6种结构蛋白以及2种非结构蛋白C和V.N、P和L蛋白形成的核糖核蛋白复合物(Ribonucleoprotein complex,RNP)包裹病毒RNA，形成大小为400～500 nm的包膜颗粒.两个跨膜糖蛋白F和H位于病毒包膜上.在包膜的内表面，M蛋白作为桥梁将F和H蛋白的胞质尾部连接到RNP上.

1.2 流行病学

PPRV宿主广泛，可在种内和种间传播和流行，除了典型宿主山羊和绵羊，在其他许多物种中也分离出了该病毒包括牛、骆驼、猪、狗和亚洲狮等.PPRV对山羊高度易感，致病率和死亡率可高达100%，但是PPRV的致病机制及传染性与菌株的毒力和宿主的种类以及年龄等多种因素有关，如不同的山羊发病严重程度不同，死亡率也不尽相同，绵羊常表现为亚临床症状，在PPRV的传播中起着重要作用[12].牛和骆驼几乎不表现出临床症状，是PPRV的死胡同宿主[13-15].而猪和野猪有可能作为PPRV的传染源[14]，对其他易感物种造成潜在的感染风险，成为根除PPR的障碍.有研究表明，PPRV的宿主谱仍在逐渐扩大[16-17].了解疾病流行地区PPRV在宿主中的流行特点，可为开发一种针对多种宿主有用的新型疫苗提供思路.

2 疫苗的开发

在麻疹病毒属6个成员中，PPRV与牛瘟病毒(Rinderpest virus,RPV)关系最近，在过去常用RPV减毒活疫苗来控制PPRV.随着RPV的根除和无牛瘟区域策略的实施，RPV疫苗被禁用.根据RPV根除经验，研究人员利用连续培养致弱的方法先后开发了4种减毒活疫苗，这几种疫苗在流行地区取得不错的免疫成效，但PPRV减毒活疫苗无法区分自然感染动物和接种动物(Differentiating infected from vaccinated animals,DIVA)并且耐热性低，导致PPR仍在很多地区相继出现并造成重大的经济损失.虽然采用稳定剂和冷冻干燥循环可提高其耐热性[18]，但这也增加了疫苗生产成本，难以在PPR流行的发展中国家推行.因此耐热的新型DIVA疫苗成为近年来的研究热点，并在重组亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗和联合疫苗方面取得了一定的成就，灭活疫苗的开发也颇具进展.

2.1 重组亚单位疫苗

重组亚单位疫苗由病原功能性结构蛋白制成，与传统减毒活疫苗相比，此类疫苗安全性更高、免疫保护性更强，是PPRV根除运动中的候选疫苗.PPRV H和F是病毒的两种主要抗原蛋白，H蛋白包含较多中和抗体表位和少数T细胞表位，主要诱导中和抗体的表达;F蛋白包含许多T细胞表位，主要诱导特异性抗体表达.这两种蛋白均能激发保护性免疫抵抗PPRV的侵害[19]，是开发PPRV新型重组亚单位疫苗的良好靶蛋白.

Rojas等构建了含PPRV F和H基因的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Adenovirus 5,Ad5)，并将该重组病毒感染HEK293A细胞，获得表达F或H蛋白以及同时表达F和H蛋白的两种重组亚单位疫苗，用肌肉接种的方法两次免疫小鼠，可诱导小鼠体内PPRV特异性B细胞和T细胞应答.攻毒试验也表明该疫苗可抵抗PPRV强毒株的攻击，使绵羊免受PPRV的侵害[20-21].Herbert等也对该重组亚单位疫苗在山羊体内的免疫原性进行了评价，结果表明,单次接种Ad-H即可诱导高水平的病毒特异性抗体和中和抗体，能完全保护山羊免受强毒PPRV的攻击[22]，阻断病毒的传播.Holzer等测定发现,0.1PFU剂量的Ad疫苗即可保护东非山羊免受PPRV攻击[23].Fakri等以羊痘病毒(Sheep and goat pox virus,SGPV)为载体表达H或F蛋白，或同时表达H和F蛋白产生重组山羊痘病毒.在山羊和绵羊身上进行安全性和有效性评估，结果发现,同时表达H和F蛋白的重组SGPV疫苗对PPR有较早和较强的免疫力[24].最近，Murr等证实，表达F蛋白的重组新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)疫苗可以预防PPR，且具有DIVA疫苗适用性和高耐热性[25]，值得深入研究.

以上研究表明,利用病毒载体制备的重组亚单位疫苗对羊群具有较强的保护作用，同时符合新型DIVA疫苗开发原则，但重组亚单位疫苗不能长时间产生高水平抗体，因此，这类疫苗在有效保护周期上存在一定缺陷.

2.2 病毒样颗粒疫苗

PPRV M蛋白可促进病毒的组装和释放，当M蛋白与H、F或N蛋白中的一种或几种结构蛋白共表达时，可自行组装成形态结构与天然病毒粒子极为相似的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)，并以出芽方式释放[26-27].VLPs表面具有高度重复的氨基酸(AA)结构，可诱导B细胞活化和产生高滴度抗体，具有较强的免疫原性和生物学活性，免疫动物时不需要添加佐剂.VLPs可通过血清学检测区分自然感染和接种疫苗的动物，并且VLPs不含感染性基因组[28-29]，不存在毒力返强的可能，是安全的候选疫苗.杆状病毒表达系能高效表达多种外源蛋白，通常只感染昆虫，对人畜不构成危害，因此,杆状病毒广泛应用于病毒样颗粒等疫苗的研制.

Liu等将PPRV开放阅读框(ORF)密码子优化的H和M以及天然N基因插入杆状病毒中构建重组杆状病毒，通过免疫共沉淀、Western blot等方法检测到M、H和N蛋白在Sf9昆虫细胞中共表达，成功构建昆虫细胞-杆状病毒系统，并通过透射电镜在细胞膜上观察到VLPs[30].产生的PPRV-VLPs经蔗糖密度梯度离心纯化后免疫小鼠和山羊，可激发较强的体液免疫和细胞免疫，保护小鼠和山羊免受PPRV的攻击[31].Li等人在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达PPRV M和H蛋白或 F蛋白，生成含M和F或M和H蛋白的两种PPRV VLPs，免疫小鼠和山羊可诱导产生特异性抗体和中和抗体，并促进淋巴细胞增殖.在不使用佐剂的情况下，含有H基因的 VLPs引起的免疫应答与使用PPRV疫苗引起的免疫应答效果几乎没有差异[32].Yan利用昆虫细胞-杆状病毒系统共表达PPRV M、H、F和N蛋白，获得含有4种与保护性免疫有关蛋白的PPRV- VLPs.将这种VLPs免疫小鼠和山羊后诱导特异性抗体和针对PPRV的中和抗体表达，产生保护性免疫[33].随后，他们又将来自IV系Tibet/30株和II系Nigeria75/1株的这4种基因分别插入杆状病毒，构建两种重组杆状病毒，在High Five高表达细胞系中共表达，产生了两种PPRV -VLPs，免疫小鼠、山羊和绵羊发现两种VLPs均能诱导较强的体液免疫应答[34].VLPs疫苗具备生产新型疫苗的全部条件，但是VLPs却不能在机体内复制，保护周期也短.另外,VLPs制备组装工艺复杂，较大程度地限制了该类疫苗的发展．

2.3 联合疫苗

联合疫苗可诱导中和反应对抗多种小反刍动物疫病，而PPRV易与其他病毒发生并发感染，如口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)[7]、蓝舌病病毒(Luetongue virus，BTV)[35]和山羊痘病毒(Goat pox virus,GTPV)[36]等，因此联合疫苗的研发就显得很有必要.Hosamani等用PPRV弱毒株和GTPV研发的联合疫苗，免疫山羊后可在山羊体内诱导保护性免疫反应，且在各组分疫苗间不存在免疫原性干扰[37].Wang等发现，Ad-H和Ad-F联合免疫能对山羊产生很好的保护作用，诱导产生的免疫反应强于单独使用Ad-H或Ad-F免疫[22-38].

反向遗传学操作系统具有开发联合疫苗的巨大潜力.该系统利用反向遗传学等技术拯救出感染性基因定点突变的RNA减毒病毒株，获得反向遗传学致弱的活疫苗株.2012年，Hu等利用“分段克隆”的方法克隆出PPRV基因组全长 cDNA，首次建立了PPRV反向遗传操作系统，并利用该系统拯救出绿色荧光蛋白(GFP)标记的重组PPRV，并且GFP可在10代以内稳定表达[39].Yin随之利用PPRV操作系统，以PPRV为载体构建表达外源FMDVVP1的重组病毒.该重组病毒株在山羊体内诱导产生PPRV和FMDV的中和抗体，抵抗FMDV和PPRV的攻击，为新型PPRV和FMDV双重活疫苗的研究开发奠定了基础[40].Liu构建反向遗传系统并在体外拯救表达细粒棘球绦虫EG95抗原的重组PPRV.虽然重组PPRV复制缓慢，但能有效地表达细粒棘球绦虫EG95抗原[41]，值得进一步研究.

利用反向遗传操作系统制备的联合疫苗毒力返强可能性小，安全性更高，且兼具减毒活疫苗的优点，但不足之处是该疫苗不具备DIVA性能.虽然耐热的新型疫苗是控制和根除该病的关键，但联合疫苗可大大降低疫苗接种成本，在小反刍动物多种疫病流行区具显著优势.利用反向遗传操作系统还可针对基因突变的PPRV制备相应的PPRV反向遗传致弱活疫苗，是解决PPRV遗传进化比较有效的措施.

2.4 灭活疫苗

Chen等用含有表达H或F蛋白的重组羊痘病毒疫苗免疫山羊，发现该疫苗可刺激产生高水平保护性免疫，但在已有抗羊痘病毒抗体存在的情况下，该疫苗对PPRV的抗体反应水平会降低，不能抵抗PPRV强毒的攻击，甚至出现临床症状[42].灭活疫苗通常不受已有抗体的影响，因此开发灭活疫苗具有一定的优势.Cosseddu等开发了一种针对PPRV的灭活疫苗，该疫苗免疫山羊36天后鼻腔感染强毒PPRV.临床显示该疫苗对PPRV的感染和复制有阻断作用[43].在PPRV非流行地区，结合佐剂菊粉和TLR9寡核苷酸激活剂的PPRV灭活疫苗具有很强的吸引力，是减毒活疫苗很好的替代品[44].但灭活疫苗诱导的抗体滴度易受时间影响，需定期接种加强其免疫效果，不利于大规模使用.

3 总结与展望

小反刍兽疫严重威胁着我国的动物卫生安全和畜牧业的发展，需要采取严厉的强制预防控制措施.目前控制该病最理想的方法是接种疫苗，因此研制安全、有效、热稳定性高的DIVA疫苗是现今研究工作的首要任务.安全可靠、可复制的动物模型不仅可以进行PPR临床症状和发病机制的研究，还可以建立评估疫苗活性和效价的动物模型，对PPR疫苗的开发具有重要意义，对联合疫苗有效性的评估也极为重要.因为制备联合疫苗时，需进行大量动物试验证明各个免疫成分之间互不干扰，方可进行本体试验.Ronchi等认为大鼠模型是预测山羊接种疫苗反应的有用模型[44].最近Enchery等建立了山羊攻毒模型，并利用该模型成功评估了减毒疫苗的活性[45].成功建立可靠的动物模型，会使我们离根除PPR目标更近一步.总之，要实现2030年全面消除PPR的最终目标，在PPR疫苗尚不成熟的今天，应积极加强对抵抗和防御外来病的宣传和教育，同时建立PPRV的动物模型，以便于PPRV病原学的深入研究，明晰其分子致病机制和临床症状，建立高效、快速的病原检测新方法，开发出高效耐热的DIVA疫苗.