脱胶条件对茧层丝胶蛋白性质的影响

彭若铉 黄添就 钟杨生 何镜新 林健荣 陈芳艳

摘要： 为了探讨脱胶条件对茧层丝胶蛋白性质的影响，文章以水为溶剂，在不同的温度、时间和浴比条件下进行脱胶实验。结果表明：温度、时间和浴比均对丝胶蛋白的性质产生显著影响。在100 ℃脱胶，3 h内丝胶的质量浓度和相对黏度均显著增加，3 h后变化不大;在浴比2.5～15 （g︰100 mL）内，丝胶的质量浓度呈直线上升的趋势显著增加，而在浴比达到7.5 （g︰100 mL）后，相对黏度才显著上升。丝胶质量浓度在70 ℃已开始显著增加，而相对黏度高于100 ℃才显著增加。温度越高，浴比越大，越有利于凝胶的形成。

关键词： 桑蚕茧层;脱胶条件;丝胶溶液;质量浓度;相对黏度;胶凝效果

Abstract： To study the influence of degumming conditions on some properties of cocoon layer sericin， water was used as solvent to separate sericin from cocoon layer under different temperatures， time and bath ratios. The results showed that temperature， time and bath ratio all had a significantly impact on the properties of sericin protein. When degumming at 100 ℃， the mass concentration and relative viscosity of sericin grew significantly within 3 h， but changed little after 3 h; When the bath ratio was 2.5～15 （g︰100 mL）， the mass concentration of sericin grew significantly perpendicularly， when the bath ratio reached 7.5 （g︰100 mL）， the relative viscosity increased significantly. The mass concentration of sericin began to increase dramatically at 70 ℃， while relative viscosity didnt increase dramatically until 100 ℃. The higher temperature and the greater bath ratio， the more easily the gel formed.

Key words： silkworm cocoon layer; degumming conditions; sericin solution; mass concentration; relative viscosity; gelling effect

丝胶包围在丝素的外面，约占茧层质量的25%，对丝素起保护作用[1-2]。近年来，随着生物医学的迅速发展，丝胶的性质和功能越来越受到关注。丝胶易溶于水，便于加工利用，有良好的吸湿性[3]，成膜性[4]，并且无毒、低（无）免疫原性[5-6]，具有促进细胞增殖能力[7]及抗菌[8]、抗酪氨酸酶和抗凝血[9]、抗癌[10]等功能特性，因而在药物载体、伤口敷料和组织工程中具有广阔的应用前景[11]。用再生桑蚕丝蛋白水凝胶负载小牛软骨细胞后，不仅能促进软骨细胞的增殖和分化，而且物理化学和力学性能、可降解性和免疫原性均较琼脂糖等材料优秀[12-14]。在丝素溶液中添加丝胶比例越高，制备的3D海绵杨氏模量就越高，应变和应力也越好，相比于不添加丝胶的对照更有利于成骨细胞的生长，且不会产生炎症反应[15]。丝胶可显著降低2型糖尿病小鼠空腹血糖值，同时降低空腹血浆胰岛素水平和糖基化血清蛋白水平;改善口服葡萄糖耐量和胰岛素耐量，并增强抗氧化活性[16]。

茧层丝胶由9种多肽或蛋白质所构成，其相对分子质量为24 000～400 000 Da，是一类蛋白质的混合物[17]。包覆在丝素外层的丝胶蛋白由中部绢丝腺前区的细胞分泌合成，内层丝胶蛋白由中部绢丝腺后区细胞分泌合成。组成外层丝胶蛋白的亲水氨基酸残基较多，因而结晶度低，最易溶于水中，而组成内层丝胶蛋白的氨基酸残基含亲水基团相对少些，因而结晶度较高，较难溶于水中。相比于外层丝胶，内层丝胶蛋白从丝素中分离需要更多的能量。脱胶的过程中，丝胶蛋白受到溶剂、热或者酸和碱的作用，氢键被打断，肽键受破坏，导致其相对分子质量和结构发生改变[18]。目前大多数研究是探讨脱胶方法、脱胶条件和脱胶剂对丝素性质的影响[19-20]，而针对脱胶条件与丝胶性质的研究报道较少。鉴于脱胶方法和条件会直接影响到脱胶的效率、丝胶的相对分子质量分布及丝胶的物理化学性质和生物学特性，对后续的开发应用会产生影响[21]。本文以水为溶剂，探索茧层脱胶条件对丝胶溶液质量浓度、相对黏度和胶凝特性的影响，为桑蚕丝胶的分离及开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料：桑蚕茧层（华南农业大学动物科学学院蚕丝科学系）。

药品：牛血清白蛋白为电泳纯（Sigma公司），考马斯亮蓝G-250、85%磷酸、95%乙醇等均为分析纯试剂（市售）。

1.2 方 法

1.2.1 脱胶方法

1）不同脫胶时间的影响。以去离子水为溶剂分离茧层丝胶，按浴比[茧层质量（g）与溶剂（mL）]5.5︰100的比例，将剪碎后的茧层110 g和2 000 mL去离子水加入3 000 mL圆底烧瓶中。首先30 ℃预热3 min，待茧层完全浸入水中后，在100 ℃条件下冷凝回流脱胶，分别于开始脱胶后的0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0 h时间点取样20 mL，测定丝胶蛋白质量浓度、相对黏度，观察放置一段时间后的胶凝现象，重复3次。

2）不同温度的影响。固定浴比，精确称取5.5 g茧层6份，将6份茧层和100 mL蒸馏水分别加入6个250 mL圆底烧瓶中，30 ℃预热3 min，使茧层完全浸入水中。分别在50 ℃、70 ℃、90 ℃、100 ℃、110 ℃、130 ℃的温度条件（100 ℃以上采用油浴控温）下冷凝回流处理3 h后，过滤得到丝胶溶液，然后取样测定丝胶蛋白质量浓度、相对黏度，观察放置一段时间后的胶凝现象，重复3次。

3）不同浴比的影响。按浴比（g︰mL）為2.5︰100、5︰100、7.5︰100、10︰100、12.5︰100、15︰100的比例分别将剪碎的25、5、7.5、10、12.5、15 g茧层和100 mL去离子水装入6个250 mL圆底烧瓶中，30 ℃预热3 min，然后在温度为100 ℃的条件下冷凝回流提取3 h后过滤，取样测定丝胶蛋白质量浓度、相对黏度，观察放置一段时间后的胶凝现象，重复3次。

1.2.2 丝胶蛋白质量浓度的测定

采用Bradford法[22]，以牛血清白蛋白为标准蛋白质。根据标准曲线y=0.004 4x+0.030 6，R2=0.995 0，计算丝胶蛋白的质量浓度。y为A595nm吸光度，x为蛋白质质量浓度（μg/mL）。

1.2.3 丝胶黏度的测定方法

参考罗艳华等[23]的方法，采用乌氏黏度计（上海申谊玻璃制品有限公司）进行测定，记录样品溶液流出时间，误差不能超过0.2 s。以溶剂作为对照，根据下式计算相对黏度值：

1.2.4 丝胶胶凝度的判定

取丝胶提取液置于4 ℃冰箱中静待胶凝，24 h后取出，横置观察样品胶凝情况。

2 结果与分析

2.1 脱胶时间对丝胶蛋白性质的影响

以去离子水为溶剂，在温度为100 ℃，浴比为5.5 g︰100 mL条件下，比较脱胶时间对丝胶蛋白性质的影响，结果如图1所示。

由图1可知，丝胶溶液的质量浓度随脱胶时间的增加而增加，以3 h为转折点，在3 h内丝胶的质量浓度随时间的增加呈线性增加的趋势快速上升（线性方程y=216.21x，相关系数R2=0.995 6）;3 h后，虽然丝胶的质量浓度仍在增加，但是上升缓慢。丝胶溶液的相对黏度亦随着脱胶时间的增加而增加，在0.5～1.0 h相对黏度增加最快，1.0～3.0 h较快，3.0 h后增加最慢。丝胶溶液的质量浓度和相对黏度均在7.0 h达到最高，分别是727.42 μg/mL和121.12%。

将7个不同时间段脱胶得到的丝胶溶液（质量浓度14644～727.42 μg/mL，相对黏度103.39%～121.12%）放置在4 ℃的冰箱中连续观察14 d，均没有出现胶凝的现象。

2.2 脱胶温度对丝胶蛋白性质的影响

固定浴比和脱胶时间，比较脱胶温度对丝胶溶液的影响，结果如图2所示。

由图2可知，70 ℃以前丝胶质量浓度变化不大，因为此阶段为丝胶膨润阶段，所以丝胶溶解量很少;在脱胶温度达到70 ℃时，进入了溶解阶段，丝胶质量浓度开始显著上升。温度达90 ℃以上时，丝胶的质量浓度随温度的增加呈线性增加的趋势快速上升（线性方程y=33.53x-2 714.1，相关系数R2=0.992 4）。在温度为130 ℃时，丝胶的质量浓度达1 612.42 μg/mL。

丝胶相对黏度在温度为100 ℃以下时变化不大，100 ℃以上时黏度显著增加，在130 ℃时相对黏度达260.17%。从丝胶质量浓度和相对黏度两条曲线的变化趋势来看，在130 ℃均未达到极限值，继续升高温度，质量浓度和相对黏度还会继续上升。受实验条件制约，最高温度设计在130 ℃。丝胶质量浓度和相对黏度在何温度下达到最大值平台，仍需要进一步实验阐明。将不同温度条件下分离制备的丝胶溶液置于4 ℃条件下放置12 h，110 ℃以上条件制备的丝胶溶液（质量浓度≥619.09 μg/mL，相对黏度≥116.11%）出现凝胶化现象（图3），凝胶颜色呈淡黄色。两组凝胶均呈现半透明状，凝胶贴于玻璃仪器内壁，无坍塌现象。倾斜玻璃仪器，凝胶会沿内壁下滑，且有液体出现，但整体依旧保持完整。而低于100 ℃条件分离的丝胶均未出现胶凝现象。

2.3 浴比对丝胶蛋白性质的影响

固定脱胶温度和时间，比较不同浴比对丝胶蛋白性质的影响，结果如图4所示。

由图4可知，丝胶的质量浓度随浴比的增加几乎呈线性增加的趋势快速上升（线性方程y=65.164x+154.32，相关系数R2=0.968 9）。丝胶溶液的相对黏度在小浴比的情况下增加不大，在浴比达7.5 （g︰100 mL）以后，相对黏度呈线性趋势快速上升（线性方程y=14.857x+3.412 8，相关系数R2=0995）。在最高浴比15 （g︰100 mL）时，丝胶的质量浓度和相对黏度分别为1 156.82 μg/mL和227.57%，从图4可知，两者均未达到极限值。受茧层体积的影响，15 （g︰100 mL）已经是最大浴比。

将不同浴比条件下分离的丝胶溶液置于4 ℃条件下放置12 h后，取出横置于桌面上，观察胶凝现象，浴比大于等于10 （g︰100 mL）（丝胶质量浓度≥818.33 μg/mL，相对黏度≥155.97%）的丝胶溶液，在4 ℃条件下放置12 h后，出现凝胶化现象，如图5所示。

综上所述，脱胶时间、温度和浴比对丝胶质量浓度、相对黏度及丝胶溶液的凝胶化效果均会产生影响。在100 ℃条件脱胶，3 h内丝胶溶液质量浓度增加显著，3 h后增加缓慢，分析主要有两方面的原因：1）脱胶过程是丝胶在热和溶剂等的作用下经历膨润溶化的渐进过程，初期经过膨润阶段之后丝胶溶出较快，丝胶溶出过程后期茧丝上的丝胶减少，脱胶率随之下降;2）根据日本学者小松计一[1]的研究，茧丝外包覆着四层丝胶，组成这四层丝胶的氨基酸组成虽然相同，但氨基酸种类不同，四层丝胶由外层到内层溶解度逐渐降低，最初溶解下来的是含亲水基团多的分布在外层的易溶性丝胶，随着时间的延长，丝胶越来越难溶解，因此一定时间后丝胶的溶解速度会降低。温度越高越有利于打断分子间的作用力，因而提高温度有利于丝胶的溶解[24]。本文研究发现，温度升至70 ℃以后，丝胶溶液质量浓度会显著增加，70 ℃以前是丝胶膨润阶段，此后丝胶才逐渐溶出;在油浴温度升高至100 ℃以后，丝胶质量浓度仍会急剧地增高，分析原因，虽然溶剂——水的沸点是100 ℃，但实际上随着丝胶的不断溶解，溶质质量浓度增加，水-丝胶溶液共沸点的温度也随之上升，因此在常压状态下也能达到100 ℃以上的温度。浴比越大，丝胶溶液的质量浓度越高，但并不意味着脱胶效率也越高。

對不同脱胶条件下的丝胶胶凝效果比较发现，在温度100 ℃的条件下所获得的丝胶，当丝胶溶液的质量浓度≥818.33 μg/mL，相对黏度≥155.97%时出现明显的胶凝现象;而在温度≥110 ℃条件下分离获得的丝胶，当丝胶溶液的质量浓度≥619.09 μg/mL，相对黏度≥116.11%即出现明显的胶凝现象。影响胶凝的因素包括质量浓度、温度及丝胶的相对分子质量，同样放置于4 ℃条件下胶凝，采用高温提取获得的丝胶，形成胶凝过程要求的质量浓度却低一些，这可能与不同温度条件下，溶解下来的丝胶种类不同有关，其原因仍有待进一步研究。

采用不同的条件分离丝胶，会影响丝胶的质量浓度、丝胶的物质组成，进而影响到丝胶相对黏度。黏度受高分子物质的相对分子质量、质量浓度和环境温度的影响，分析不同脱胶条件的丝胶质量浓度与相对黏度的关系（图6），发现丝胶质量浓度在达到一定的数值后相对黏度就会显著上升，而低于此数值则黏度变化不大。相对黏度与质量浓度之间的这种变化趋势有待进一步研究。

3 结 论

脱胶温度、时间和浴比对丝胶蛋白的质量浓度、黏度和胶凝特性会产生影响。时间在3 h内的影响比较大，丝胶的质量浓度和相对黏度在3 h内都显著增加，之后变化不大。在70 ℃以前为丝胶膨润阶段，在温度低于70 ℃脱胶，对丝胶质量浓度影响不大;70 ℃以后随着温度的上升，丝胶质量浓度显著增加;100 ℃以前分离的丝胶相对黏度变化不大，100 ℃以后分离的丝胶相对黏度显著增加。浴比2.5～15 （g︰100 mL）对丝胶质量浓度产生显著影响，随着浴比的增加，丝胶的质量浓度几乎呈直线上升的趋势;而在浴比上升到7.5 （g︰100 mL）后，才对丝胶的相对黏度产生显著的影响。100 ℃分离的丝胶，形成胶凝的质量浓度要求是大于等于818.33 μg/mL，而110 ℃以上高温条件分离的丝胶形成胶凝的质量浓度要求是大于等于619.09 μg/mL。

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