生物技术药物免疫原性检测中改善药物耐受研究进展

陈沛卓，洛文靖，程远国，任欣怡

（1.复旦大学药学院，上海201203；2.上海益诺思生物技术股份有限公司，上海201203；3.中国医药工业研究总院，上海201203）

免疫原性是指免疫系统感知到生物制品中的“外来或非自我”或“危险信号或应激自我”，并对其产生特异性的免疫反应。随着更多的治疗性蛋白在市场上的出现，被治疗患者抗药抗体（anti-drug antibody，ADA）反应的发生率正在上升［1］。所有生物技术药物都有可能引发宿主免疫反应，这可能会导致无可预估的临床后果或出现罕见又严重的不良事件［2］。非临床研究表明，它们会中和药物的活性，影响药物的清除、血浆半衰期和组织分布，改变药效或药动学，使在非临床研究中观察到的效应可能并非药物真正的药理和（或）毒性反应［3］。临床研究发现，ADA 与药物及内源性同系蛋白结合（交叉反应）后，可能会导致该蛋白缺陷综合征，对药物的免疫应答导致过敏反应，甚至特异质反应［4］。免疫原性检测是生物技术药物临床安全性评价的组成部分，药物引起的免疫原性反应（中和抗体和非中和抗体）可影响药动学、药效和（或）毒性。因此，在非临床和临床研究中监测和评估ADA非常重要。

目前免疫原性检测方法有很多，常用的检测方法包括ELISA 如桥联法（双抗夹心法）和直接法等、电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）检测、放射免疫法和表面等离子共振法等。ADA 检测结果有助于解释药物的免疫原性、药动学、药效学、安全性和有效性。但是检测的准确与否取决于分析方法的部分重要参数，如灵敏度和药物耐受及特异性等。此外，还受其他多种因素的影响，包括检测方法、样本处理、样本采集时间、药物联用和疾病状况等，所以待检样本为其主要影响因素之一。由于待检样本中的成分较为复杂，既包括游离ADA，也有ADA 与过量药物结合形成的ADA-药物复合物，可导致假阴性结果。对于长半衰期抗体药物，此问题尤其突出［5］。

1 药物耐受

临床Ⅲ期关键性试验中所获得的样本应使用经过充分验证的分析方法进行检测。在申请药物上市许可时，需要提供该方法经过全验证的证明数据。全验证需要证明该方法对于预期的ADA 检测是适用的，其基本验证项包括临界值、灵敏度和药物耐受、特异性和选择性、精密度、相关的重现性、某些测定条件的稳健性和关键试剂的稳定性。药物耐受是指在一定阳性对照抗体存在的情况下，可被连续检测为阳性时的最高药物浓度，该验证项的目的是评估生物技术对药物干扰的抵抗能力，是方法开发中的关键因素之一。

因操作方便、快捷及其高通量的检测能力，ELISA常被用于免疫原性检测。免疫原性检测大多采用桥联ELISA，通过包被药物，用标记的药物检测。此法的优点是能检测各类抗体亚型，无种属特异性，可高通量检测；缺点是不易检测到低亲和力的抗体，包被或标记时可能会掩盖或改变药物的抗原表位，易受药物本身的干扰。直接法则通过包被药物，用标记抗体检测。此法的优点是可能增加检测低亲和力抗体的能力，可高通量检测；缺点是包被时可能会掩盖或改变药物的表位，仅检测单一亚型，有种属特异性，多次洗涤后低亲和力抗体丢失。由于交叉反应的存在，直接ELISA 不适用于治疗性单克隆抗体药物的检测。

从受试者获得的血清或血浆样品是各种因子的复杂混合物，其可能干扰免疫原性测定中ADA 的检测。样本中既包括游离的ADA，也有ADA-药物复合物。药物本身是干扰因素之一，在待测样本中药物的含量过高时，用作捕获和（或）检测的标记形式的药物可能无法与样品中的未标记药物竞争［6］，无法形成“夹心复合物”，导致免疫原性测定中潜在的假阴性结果。药物耐受作为方法开发过程中主要关注点之一，尽可能消除药物对测定体系的干扰，可改善免疫原性检测中药物耐受的问题。

2 改善药物耐受的方法

改善免疫原性检测中药物耐受问题，可以从2 个角度考虑：①将药物从待测样本中去除。ADA检测的主要干扰物质为药物本身，因此最直接的方法就是将药物从待测样本中清除，分离去除游离药物，减少药物干扰；②破坏血清中ADA-药物复合物。当ADA 以复合物的形式存在时，无法参与形成信号通路，使测定信号值比实际偏低，通过酸解离可将ADA从ADA-药物复合物中解离。

药物耐受作为免疫原性检测方法领域的主要挑战之一，本文归纳目前常用的改善药物耐受的方法，包括液相ELISA、酸解离、沉淀与酸解离（pre⁃cipitation and acid dissociation，PandA）、磁珠提取与酸解离（bead extraction and acid dissocia⁃tion，BEAD）和磁珠提取与热解离（bead-extraction and heat-dissociation，BEHD）。

2.1 液相ELISA

固相ELISA 是免疫原性测定应用最广泛的测定方法，其操作简单，灵敏度高，测定成本低，但其药物耐受低。为解决药物耐受低的问题，液相ELISA保留了ECL 平台的样品处理方法（均相），即把样品的前处理置于液体环境中，将生物素标记的药物和地高辛标记的药物混合（命名为Master Mix 溶液），待测样品与Master Mix 溶液进行过夜孵育，使其充分形成免疫复合物。在孵育结束后，用链霉亲和素包被的板上捕获免疫复合物，并使用抗地高辛抗体-辣根过氧化物酶和TMB 显色液进行检测。液相ELISA更换了检测系统，保持了ECL的一些优势［7］，如均相孵育使整个体系处于动态平衡状态，更有利于形成正确的信号通路，从而提高对游离药物干扰的耐受性；而且方法稳定可靠，可减少对专用设备的依赖［6］。

2.2 酸解离

通过对样本进行酸化，使样品的pH 值处于可使ADA-药物复合物解离但不失ADA 活性的范围内，通常选用盐酸或醋酸进行酸化，于37℃下进行温育使解离更充分彻底［6］。在检测前对样品进行酸解离［8］，可降低样品中复合物对结果的干扰。需要注意的是，在酸解离后要进行样品中和，以确保样品与相应配体桥接，而此时也可使已解离的复合物重新结合，影响实验结果。因此，需要优化条件如pH 值和酸暴露时间，以实现最大程度地减少干扰。运用酸解离的样品处理方法有以下2种。

2.2.1 亲和捕获洗脱

亲和捕获洗脱（affinity capture elution，ACE）使用2 块96 孔板，一块用于酸化，分离ADA-药物复合物；另一块则将ADA 包被于板上，生物素标记的药物作为检测试剂，用酶标仪测定吸光度值。用ELISA 系统和ECL 系统对ACE 进行测试后发现，ELISA系统灵敏度更高，药物耐受更好［4］。

ACE 在正常内源性抗原浓度下无干扰，因此更适合进行免疫原性测定。ACE 敏感度高，药物耐受高，很少或无内源性抗原干扰或钩状效应。ACE 的另一个优点是可以增大检测信号，用简单的ELISA即可进行测定。

2.2.2 固相萃取与酸解离

固相萃取与酸解离（solid-phase extraction with acid dissociation，SPEAD）［4］也是一种样品前处理方法。首先将生物素标记的药物加入到样品中，并在室温下过夜培养。次日将生物素标记的药物复合物在室温下结合于链霉亲和素板。通过酸解离ADA-药物复合物，消除可能导致干扰分析的过量未结合的药物和其他血清蛋白，使游离的ADA 直接结合在ELISA板的表面。

这种方法有两方面的限制［9］：①一些ADA 和（或）中和抗体（neutralizing antibody，Nab）具有高亲和力和非常低的解离速率，因此过夜孵育不足以形成生物素-药物和（或）ADA 复合物的新平衡。②高吸附板具有有限的吸附能力，限制了生物素标记药物的添加量；如果测试样品中的药物过多，添加的生物素标记药物的有限量只能回收一部分ADA 和（或）NAb，造成药物耐受差，Nab 检测准确率低。总的来说，SPEAD 虽然在敏感性和药物耐受方面与ACE 非常相似；不同的是SPEAD 中使用链霉亲和素板去捕获生物素标记的药物［10］，消除了放大检测信号的可能性并导致需要ECL 系统，也意味着对抗原干扰更敏感，且专用仪器和材料的成本增加。

2.3 沉淀与酸解离

尽管上述方法对药物耐受有所改善，但其无法保持高灵敏度和相对准确性，因此在被治疗患者中仍存在假阴性和低ADA 发生率的风险［11］。此方法中聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）沉淀的目标分子或ADA-药物复合物是基于自身相对分子质量的大小，并由PEG 自身浓度所决定。PEG 浓度越高，相对分子质量越低的目标分子越易沉淀。为了减少非特异性血清蛋白如白蛋白和免疫球蛋白的沉淀，常采用低浓度PEG 沉淀相对分子质量高的药物形成ADA-药物复合物。利用PandA 在酸性条件下吸附在高容量板的表面（防止重新结合），可用特定的检测试剂检测ADA 或目标药物。PandA 利用沉淀原理和酸解离，先将样品中加入过量药物，孵育形成ADA-药物复合物。尽管有些样品可能已含有与药物有关的抗体，但这一步骤可确保样品中任何剩余的游离ADA 均与药物结合。然后在样品中加入PEG 溶液，并在2～8℃下进行过夜温育，使总ADA 沉淀。第2 天，离心样品使复合物沉淀成小颗粒，吸出上清液。在最终离心和去除上清液后进行酸解离，将游离ADA 结合在链霉亲和素板上，而后加入钌标记的药物，选用ECL进行检测。

与酸解离相比，PandA 方法的优点在于其在高药物浓度下仍可完全消除药物干扰，并且保持测定灵敏度。PEG 沉淀已在文献中描述用于表征循环免疫复合物［12］，并且使用放射免疫沉淀测定胰岛素和胰岛素衍生的药物产品的ADA［13］。无论样品中存在多少药物，分析抗体滴度时均可使用该方法。该方法原理可用于减少或消除任何类型免疫测定中的干扰［11］。

2.4 磁珠提取与酸解离和磁珠提取与热解离

BEAD 方法采用酸解和过量生物素结合2 个步骤从血清中提取ADA［14］。首先酸处理是将ADA 从所有复合物中释放出来，这些非特异性和特异性复合物可能竞争或阻断药物捕获并引入ADA 假阴性信号，从而低估总ADA 的量。其次通过在链霉亲和素包覆的磁珠上与过量的生物素标记的药物结合提取游离ADA。ADA-生物素标记药物在磁珠上分离并洗涤后，利用酸解作用将其从珠上分离出来，再与可溶性生物素标记药物结合，捕获在MSD 板上，ECL直接检测。

BEAD 预处理已成功应用于ADA 分析验证，准确度高，并具有有效提高分析灵敏度和消除药物或基质干扰的能力。BEAD 预处理具有高效率和高准确率的特点，过量生物素标记药物的添加可充分提取游离ADA，减少损失。该方法原理不仅是ADA测定的有效策略，也是Nab、药动学和生物标志物分析的有效策略。

尽管BEAD 方法已成功应用于多种NAb 分析，但一篇研究论文中提到，在对15组Nab检测过程中发现，其中一组Nab 回收率低，原因是其遇酸不稳定，蛋白质结构发生改变，因此不能进行酸处理［9］。这意味着实际测试样品中存在不耐酸的ADA，并且在BEAD 提取后可能检测不到。对于酸不稳定的样本，可选用其他处理方法，如BEHD［9］。

BEHD 与BEAD 类似，均用磁珠进行。不同的是，BEAD 用的是酸解离ADA；而BEHD 则用热解离ADA。将样品设定在62℃下振荡孵育，62℃加热步骤不仅解离Nab-药物复合物以取代BEAD 中的酸处理，而且还不可逆地使样品中的大部分药物变性，留下完整的NAb。该方法具有良好的准确度、精密度和灵敏度，其方法运用有待于后期更多研究结果。

3 结语

2019 版美国FDA《免疫原性指导原则》［15］指出，药物耐受可通过使用破坏ADA-药物复合物的酸解等方法进行改进。由于某些因素如方法选择性、药物性质和阳性对照抗体类型等会影响药物耐受，因此在方法开发过程中要对这些因素进行评估。当药物是酸不稳定的或靶点性质特殊［13，16］时，酸解离可能会破坏药物-靶点复合物，释放多余靶点使得靶点干扰增多，在中和样品时药物靶点与捕获和检测试剂桥接，导致筛选测定中出现假阳性结果［17］。因此，可以通过在药物谷浓度水平（CTrough）下收集血清样本，最大限度地减少来自药物的干扰。而在方法开发前期，是否对样本进行酸化，需要对药物和靶点性质进行综合评估。

由于药物干扰的问题，样品合适的前处理方法可以改善药物耐受。受试者对药物产生ADA 的免疫反应风险因产品而异，准确可靠的免疫原性检测方法可用于评估生物技术药物的免疫原性或者免疫相关的不良临床反应。由于酸处理操作简便被广泛使用，但酸处理并不适用于所有药物的免疫原性检测，van Schouwenburg 等［18］在研究中考察了采用酸处理方法检测的ADA 结果与实际临床免疫反应间相关性，受试者为99 例使用阿达木单抗（adalimumab）治疗3 年的类风湿性关节炎患者。研究结果显示，ADA 检测为阳性和阴性患者在实际临床疗效中无统计学差异，其临床相关性有限。BEAD 和BEHD 方法由于需要磁珠的参与，检测成本问题限制了其应用。PandA 方法可以有效消除药物干扰，但操作步骤复杂，周期长，无法广泛应用于大样本的检测。

生物技术药物是目前药物研发的热点，但几乎所有的生物技术药物都会有一定程度的免疫原性，可能会降低药物疗效或导致严重的不良反应。因此，生物技术药物的免疫原性评价越来越受重视。选择最佳的检测方法，是抗体药物发展需要重点考虑的一个环节。虽然方法众多，但每种方法都有各自的优缺点和针对性，没有哪一种单一的方法，可以适合所有生物技术药物免疫原性的评估。因此，在实际方法开发过程中，要根据药物的实际情况采取最佳的检测方法。