NLRP3 炎症小体在KOA 发病机制中的作用研究

廖太阳,王培民,张农山,吴 鹏,丁 亮∗

(1.江苏省中医院,南京 210029;2.南京中医药大学附属医院,南京 210029)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)作为老年人常见的关节退行性疾病,衰老,劳损和外伤等复杂的因素都会影响滑膜和软骨从而导致关节破坏和临床一系列症状。 最近一项研究表明美国就有1400 万人患有膝骨关节炎,值得注意的是,超过一半患者年龄在65 岁以下且女性比男性更易好发膝骨关节炎[1]。 目前认为KOA 属于全关节疾病,其病理过程包括软骨的进行性丢失和破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成、不同程度的滑膜炎症、韧带和半月板退变及整个关节囊的退变,临床常见关节刺痛、短暂的晨僵、活动障碍,发展为终末期的残疾不得不关节置换[2]。 尽管目前KOA 的发病机制尚未阐明,但是控制炎症已成为目前治疗KOA 的有效策略[3]。近些年来研究报道了NLRP3 炎症小体(nucleotidebinding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)参与OA 的发病过程,如Toll 样受体(tolllike receptor,Toll)及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)通路导致软骨退变和滑膜炎症。 本文将最新关于NLRP3 炎症小体与KOA 关系的研究作一系统综述,深入探寻KOA 炎症发病机制,进一步完善KOA 病理机制。

1 NLRP3 炎症小体信号通路

1.1 概述

NLRP3 炎症小体首先被Martinon 等[4]描述为经半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine proteinase-1,Caspase-1)加工和激活炎性细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的一种大型多聚体蛋白复合物。 NLRP3由三个域组成:氨基末端吡啶结构域(PYD),中央NACHT 结构域和富含羧基末端亮氨酸的重复序列(LRR)。 研究认为NACHT 中央结构域具有ATP 结合活性促进NLRP3 的寡聚化,LRR 结构域则与NACHT 结构域形成抑制性相互作用,PYD 结构域允许NLRP3 与其他炎症小体蛋白相互作用[5]。NLRP3 炎症小体是焦亡中被研究的最为透彻的亚型,其它亚型包括黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2,AIM2)、NLRP1 等[6]。 NLRP3 在细胞质中,模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)参与先天免疫主要通过识别病原相关分子模式(pathogen-related molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-related molecular patterns,DAMPs),进而激活NLRP3[7]。 NLRP3 炎症小体由NLRP3 炎症体感受器蛋白、凋亡相关的斑点样蛋白ASC(含一个氨基末端PYD 和一个羧基末端CARD)及Caspase-1 前体蛋白组成,并且在巨噬细胞、树突状细胞和脾脏中性粒细胞容易发生NLRP3活化。 NLRP3 炎症小体通路属于经典炎症小体焦亡途径(Caspase-1 介导)、除此之外还存在非经典炎症小体焦亡途径(Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11介导)及凋亡蛋白Caspase-3 介导的焦亡途径。 在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)[8]、阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)[9]等疾病中已有众多的研究表明NLRP3 是其疾病发生发展的潜在机制,但在KOA 中仍属于新兴领域,有待深入研究。

1.2 NLRP3 炎症小体的分子机制

NLRP3 炎症小体是机体重要的免疫保护机制,可防止细胞因子过多产生对组织的损害,保护机体免受微生物感染和内源性危险信号的侵害,然而,失调和过度的炎症反应可以造成的组织损伤和炎症被认为是疾病发生的重要原因[10]。 NLRP3 炎症小体的分子调节机制涉及翻译后修饰(泛素化和磷酸化),蛋白激酶和自噬[11]。 如蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)、NIMA 相关激酶7(nima associated kinase 7, Nek7) 等通过自身磷酸化来调节NLRP3[12]。 有学者认为自噬通过活性氧(ROS)的调节,降解炎症体成分、pro-IL-1β 和功能障碍的线粒体防治NLRP3 的过度激活,被认为发挥保护效应[13]。 然而,也有学者观察到促进自噬可以抑制NLRP3 介导的炎症反应,表明自噬可能促进OA 进程[14]。 已提出NLRP3 激活的两个信号模型:第一步是在转录水平上启动,其中TLRs 识别PAMPs 或DAMPs 以激活NF-κB 介导的信号传导,这增加了pro-IL-1b,pro-IL-18 和NLRP3 蛋白的产量。 第二步是激活信号,该信号启动NLRP3 寡聚并导致NLRP3,ASC 和pro-Caspase-1 聚在一起形成炎症小体。 随后pro-Caspase-1 发生自我剪切活化为Caspase-1 p10、Caspase-1 p20,Caspase-1 被活化过后能将pro-IL-1β、 pro-IL-18 剪切为成熟的白介素-1β、白介素-18 大量释放至胞外,募集更多的炎症细胞(HMGB1、白三烯、前列腺素等)导致炎症的级联放大[15]。

除此之外,对于NLRP3 炎症小体活化,已提出了几种分子机制,包括钾离子流出,钙离子信号,溶酶体破坏,线粒体功能障碍,代谢产物和反高尔基体。 钾离子流出在ATP、成孔毒素、晶体、颗粒等因素刺激导致细胞内钾的水平降低,在NEK7 作用下直接结合活化NLRP3[16]。 钙离子信号具有协调K+外流,阻断的Ca2+流通将抑制NLRP3 炎症小体的组件和活化[17]。 溶酶体破坏释放组织蛋白酶B 直接结合NLRP3 炎症小体,并促进NLRP3 炎症小体的活化[18]。 线粒体功能障碍和线粒体 ROS(mitochondrial ROS, mtROS) 和 线 粒 体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的释放是NLRP3 炎症小体激活的另一个重要诱因,比如NLRP3 激活剂引起ROS 升高后, 硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)介导的氧化还原应激激活NLRP3 炎症小体[19]。 另一项研究表明高尔基体通过线粒体相关内质网膜上的蛋白激酶D 信号传导参与NLRP3 激活[20]。 此外,几种感染性微生物(结核分枝杆菌等)被证明可以激活NLRP3 炎症小体[21]。 最近调查还发现抑制NLRP3炎症小体可以预防和减缓衰老的过程[22],总之,NLRP3 炎症小体是机体面对细菌,真菌和病毒感染的关键宿主免疫防御机制,随着研究的深入,NLRP3炎症小体将为许多疾病的治疗提供更多思路。

2 NLRP3 炎症小体与KOA

2.1 NLRP3 炎症小体与软骨退变

软骨退变是与KOA 最常见的病理改变,软骨细胞(软骨中唯一的细胞类型)合成并包裹在细胞外基质中。 在健康状况下,软骨细胞负责维持新的细胞外基质的合成与去除旧软骨组织之间的平衡。软骨处在密闭环境之中,获取营养和氧气较为困难,因此作为一种高度敏感的细胞,外在刺激造成的机械损伤而引起的炎症通常会激发它们的活化并减少软骨细胞的数量,这直接导致软骨细胞调节作用的失衡,软骨细胞进一步活化会促使促炎性介质和基质金属蛋白酶的产生,造成软骨不可逆的损伤及其它组织损害。 NLRP3 炎症小体是组织损伤和修复的重要机制,深入研究背后的机制有望满足受损软骨组织修复的需要。

软骨周围的巨噬细胞在DAMPs 或者PAMPs 的影响下激活Caspase-1,释放NLRP3 炎症小体,软骨表面释放大量的白介素-1β、白介素-18,增加了软骨细胞中促炎因子的释放,炎症因子的募集刺激软骨细胞分泌引起软骨分解代谢酶,如基质金属蛋白酶13(metalloprateinase-13,MMP13)和血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs - 5,ADAMTS5)从而导致软骨破坏[23]。 目前在KOA 领域中NLRP3 炎症小体与软骨的研究如下:

He 等[24]在研究较少的机械负荷与软骨损伤的关系上发现,较少的机械负荷通过减少NLRP3 炎症小体的活化减轻了KOA 关节的软骨破坏,软骨下骨变化。 Yang 等[25]人利用生物信息学分析关节软骨中与运动相关的基因发现适度的机械刺激可以通过抑制TRAIL/NF-κB/NLRP3 通路来改善软骨退变和软骨细胞损伤。 Zu 等[26]在碘乙酸钠处理的Wistar 大鼠KOA 的模型中发现淫羊藿苷通过抑制NLRP3 / Caspase-1 信号传导途径改善软骨损伤从而减轻了KOA 的病理改变。 Xu 等[27]在小鼠半月板失稳模型中发现MMP-13,NLRP3 表达升高,关节内注射雷帕霉素可抑制NLRP3 活性并预防骨关节炎。 Gao 等[28]研究发现氯雷他定治疗后减轻了SW1353 软骨细胞中的氧化应激,同时抑制了TXNIP 和NLRP3 炎症小体复合物的表达。 Wang等[29]研究发现熊果酸通过NF-κB/ NLRP3 炎症小体途径可改善大鼠前交叉韧带横断诱导的OA,改善软骨退变。 综上可以发现,尽管这一两年涌现出不少关于OA 软骨与NLRP3 炎症小体的研究,比如在机械应力/刺激方面作用下软骨与NLRP3 炎症小体,不同KOA 模型软骨损伤与NLRP3 炎症小体关系,不同的治疗方式通过NLRP3 炎症小体或与其它作用途径的串联缓解软骨损伤,甚至与微小RNA、氧化应激、外泌体、衰老、自噬等联系起来,尽管大多研究停留在表面,但可以预料随之研究的持续深入,NLRP3 炎症小体与软骨退变的研究未来会有更令人惊喜的发现。

2.2 NLRP3 炎症小体与滑膜炎症

滑膜炎症是软骨退变的重要原因之一,参与软骨降解的IL-1β 可能是滑膜细胞产生的而不是软骨细胞。 滑膜炎症在RA 研究相对较多,遗传学研究已经证明RA 滑膜组织编码NLRP3 炎症体成分(包括NLRP3、ASC 和Caspase-1)的基因显著上调[30]。此外,KOA 患者滑膜中NLRP3 的蛋白水平表达量是正常患者的5.4 倍以上[31]。 在KOA 患者滑液中发现滑液尿酸水平与滑液IL-18 和IL-1β 密切相关,认为滑液尿酸可作为评价KOA 严重程度的标志之一,而已知尿酸可以激活NLRP3,这说明滑液NLRP3、尿酸和炎症因子存在复杂的关系网络[32]。总之,在骨性关节炎滑膜巨噬细胞中,炎症小体,如NLRP3,在不同的DAMPs 作用下被诱导并释放到滑液,关节液和周围组织中。 在滑膜巨噬细胞和软骨细胞参与的一系列炎症反应中增加了IL-1β 水平,刺激产生更多的促炎细胞因子。

近些年文献报道了NLRP3 炎症小体与滑膜炎症的研究。 Zhao 等[33]较早的在KOA 患者滑膜中发现NLRP1 和NLRP3 炎症小体参与成纤维样滑膜细胞(FLS)焦亡。 Chen 等[34]也在KOA 患者的滑膜组织中发现Nrf2/HO-1 信号可能是激活NLRP3 炎症小体的关键途径。 Li 等[35]则发现蔓荆子黄素可通过抑制HIF-1α/ NLRP3 炎症小体激活来减轻MIA诱导的KOA 滑膜炎症。 Xiao 等[36]进一步研究发现NLRP1 和NLRP3 炎症小体介导的FLS 焦亡可以增强高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1,HMGB1)的分泌,有望为减少KOA 滑膜炎症提供新的治疗策略。 此外,miR233 调控NLRP3 炎症小体参与滑膜损伤,这可能是KOA 发病的重要机制[37]。 有学者深入研究膝关节缺氧环境与NLRP3炎症小体为代表的焦亡研究中指出,膝关节炎症缺氧导致缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)升高,导致NLRP3、Caspase-1、GSDMD等表达升高,进而加重KOA 滑膜炎症及纤维化[38-39]。 有研究表明靶向NLRP3 途径可能是某些中医药发挥疗效的机制,如“易层”贴敷疗法可通过NLRP3/Caspase-1 炎症小体通路治疗KOA 滑膜炎症,改善膝关节外周痛敏[40-41]。

在2016 年Clavijo-Cornejo 等[31]发现NLRP3 在KOA 患者滑膜中升高这5 年以来,关于NLRP3 炎症小体与滑膜炎症的研究逐渐增多,尤其是这两年,说明这一研究正得到大家广泛的兴趣。 但是研究仍较少,NLRP3 炎症小体在KOA 的深入研究有待于进一步发现,尤其是需要使用更高级的技术,去探究细胞内部的结构及与不同分子间的相互作用,更需要开展更多的动物实验将滑膜与更多的组织(如软骨组织、髌下脂肪垫等)联合起来共同研究,探究不同组织甚至器官间的Crosstalk 作用及机制。 此外,滑膜炎症作为药物开发的重要方向,要利用更高级的技术阐释背后的机制及开发针对NLRP3 炎症小体靶点的药物,以期做到早期诊断、早期干预及有效预防干预滑膜炎症。

2.3 NLRP3 炎症小体与KOA 疼痛

疼痛是KOA 最典型的症状之一,来自外界的伤害刺激信号能够敏化中枢神经和外周神经,并伴有大量炎症性和非炎症性病理状态。 NLRP3 炎症小体已牵涉到许多痛苦的疾病和病症,比如膀胱疼痛,神经性疼痛,类风湿性关节炎,痛风,偏头痛等[42]。 关于疼痛的机制在此不再赘述,我们只简单讨论在NLRP3 炎症小体导致疼痛激活的机制以及抑制NLRP3 炎症小体介导镇痛作用。 NLRP3 炎症小体的激活导致的疼痛可能跟炎症因子的释放与募集有关,IL-1β 释放后,可能通过改变几种神经元离子通道和受体的功能来增加伤害感受器的兴奋性,因此IL-1β 被认为是一种神经调节剂。 此外IL-1β 还介导内源性分子的产生进一步促进外周致敏作用,例如神经生长因子(nerve growth factor,NGF),前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2),环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和降钙素基因相关肽[43]。 NLRP3 的激活还导致活性白介素18 的释放,已发现IL-18 可导致肌肉疼痛,癌症引起的骨痛[44-45]。 关于抑制NLRP3 炎症小体介导镇痛研究上,有研究报道MCL950 作为一种特定的NLRP3 拮抗剂,可减轻机械性异常疼痛,升高脊髓中的NLRP3,ASC,Caspase-1 和IL-1β 的表达水平[46]。

大多数KOA 疼痛是由周围神经的变化引起的,正常情况下,神经伤害性感受器位于特定的组织中,只能检测到本区域的感觉。 在OA 的发展过程中,过量的炎症因子、细胞因子、趋化因子、机械刺激和过度的感觉和交感神经支配导致伤害性刺激信号的扩大[47]。 炎症小体上调促炎细胞因子的产生,增加关节组织的伤害性刺激信号,导致疼痛的持续放大以致难以忍受,这个过程被称为“痛觉过敏”。 此外,在炎症小体导致的慢性炎症中,受损害的是整个关节,这包括软骨破坏、滑膜炎症、骨赘的产生及骨的破损,这些病理改变伴随异常血管和神经网络的生成,由于神经的生长比血管缓慢,新形成的血管神经支配减少,更易受到化学和机械刺激导致OA 疼痛[48]。 针对KOA 疼痛,有学者提出从TRP 离子通道出发控制外周疼痛具有治疗意义[49]。但是目前在KOA 领域仍然缺乏NLRP3 炎症小体引发疼痛的高质量证据,仅从表型观察到通过NLRP3炎症小体通路可以抑制炎性疼痛、改善大鼠疼痛样行为和降低疼痛因子表达[50]。 我相信探究NLRP3炎症小体与疼痛的研究正在受到重视,未来会有更深入的调查。

3 结论和展望

综上所述,NLRP3 炎症小体参与了KOA 软骨退变、滑膜炎症及疼痛的发生,NLRP3 炎症小体及调控的细胞因子是KOA 治疗有希望的靶点,但是有必要进一步在KOA 中阐明NLRP3 激活和调节的机制。 膝骨关节炎的发生发展除了软骨和滑膜的作用外,软骨下骨、关键韧带和肌肉也发挥了重要作用,并且伴随病变,所以将NLRP3 与这些关键组织的退变关系联系起来将是未来研究的重要方向。此外,进一步的研究应该集中在软骨细胞、滑膜细胞和其他非巨噬细胞的机制上,以阐明这一细胞死亡过程是如何在细胞中介导的,提高我们对NLRP3炎症小体介导KOA 发生机制的理解,帮助阐明KOA 发病的机制。 总体而言,NLRP3 炎症小体及调控的细胞因子是诊断和监测KOA 的一个有效生物标志物,针对NLRP3 的药物开发及治疗可能是KOA 的潜在的策略。