SARS-CoV-2病毒载量及其临床意义

陈爱平，李天萍，凌 华，张拥军

1 前 言

SARS-CoV-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)全球疫情已经持续1年多，给全世界的社会生活和经济带来前所未有的深远影响。COVID-19的实验室诊断主要采用病原学证据，包括从患者样品中分离病毒，并检测病毒相关抗原、病毒核酸或序列及病毒相关抗体等，其中以病毒核酸检测最直接、最常见[1-3]。通过对疑似感染者、密切接触者、重点人群进行病毒核酸筛查，能够及时发现感染者并采取隔离措施，是目前确定传染源、评估隔离效果、遏制病毒进一步传播扩散的重要公共卫生策略。SARS-CoV-2的核酸检测体系，按照原理可分为常规逆转录PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)、实时荧光RT-PCR(real time reverse transcription PCR)、等温扩增、数字PCR(digital PCR, dPCR)、基因组测序、基因芯片等多种手段[1-3]。其中应用最广泛的核酸检测方法就是实时荧光RT-PCR，不仅能够显示检测对象的感染状态，还能够对阳性样品中病毒RNA进行定量。

病毒载量(viral load)是用于描述人体内病毒总量的一个术语，通常采用核酸扩增方法，以标准体积的体液(如血液、血浆、脑脊液等)里检出的病毒核酸拷贝数(copies/mL)来表示[4]。检测病毒载量在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)等领域应用较多，已经有多种高度敏感、特异、准确的商品试剂盒获得美国食品药品管理署(Food and Drug Administration，FDA)和欧盟CE(Conformité Européenne)许可，并在国内外临床实验室使用，用于明确诊断、评估感染严重程度及监测抗病毒治疗效果。由于COVID-19属于新发传染病，疾病相关背景知识仍处于不断完善的阶段，目前对SARS-CoV-2病毒载量及其临床价值还缺乏统一的认识。本文拟简要介绍SARS-CoV-2病毒载量的测定方法，总结感染者体内病毒载量分布及动态变化，进而分析相关数据与患者临床表现、疾病进程及预后的联系，以促进根据病毒载量结果开展患者精准管理、部署COVID-19防控策略。

2 SARS-CoV-2核酸检测体系及病毒载量检测概述

COVID-19疫情暴发之后，中国科学家迅速确定了病原体为SARS-CoV-2，并及时与全世界科学家分享了病毒基因组序列[5]。根据基因组序列信息，国内外众多研究机构和体外诊断试剂生产厂商随后立即研制出不同的核酸检测体系，陆续获得相关监管部门的认证和生产许可并投放到市场，在全球疫情应对过程中发挥了重要作用。其中，能够对患者样品进行SARS-CoV-2核酸定量检测的方法主要包括实时荧光RT-PCR和数字PCR两种。

2.1 实时荧光RT-PCR 实时荧光RT-PCR是在传统RT-PCR体系中加入荧光基团，根据荧光信号强度连续监控扩增产物的增加，通过标准曲线对初始样品中模板RNA进行定量分析。SARS-CoV-2核酸检测试剂中，最常见的是TaqMan探针法，具有灵敏度高、特异性好、能够定量检测病毒RNA的优点，普遍被认为是COVID-19实验室诊断的金标准[1-3]。检测靶标包括冠状病毒特异的结构蛋白基因如S、E、N基因，以及SARS-CoV-2种特异性的非结构蛋白基因如RNA依赖的RNA多聚酶(RdRp)、ORF1a、ORF1b[1-3]。模板定量的基础是扩增过程中产物荧光信号达到设定的阈值时所需要的循环次数即循环阈值(Cycle threshold,Ct)。Ct值与反应体系中靶基因的核酸总量的对数成反比，起始模板浓度每降低10倍，Ct值约增加3.3，因此可以作为临床样品中病原体浓度的相对指标。在相同检测体系和反应条件下，根据已知不同浓度标准品的Ct值绘制标准曲线，就可以计算出样品中模板RNA实际浓度[2]。

在实际工作中，面对不同目的(如群体筛查、个案追踪、隔离、出院、旅行、复工、复学等)带来巨大的SARS-CoV-2核酸检测需求，通常以实时荧光RT-PCR检测所得的Ct值间接反映样品中病毒载量，仅在一些科研工作中绘制标准曲线，获得并报告病毒载量数值。值得注意的是，样品的Ct值易受到多种因素影响，包括采样质量、核酸提取、PCR扩增试剂及检测的靶基因等[2]。不同厂商的试剂盒敏感性存在差异，例如，截至2020年11月20日，我国共批准24种SARS-CoV-2核酸检测试剂，其中17种基于实时荧光RT-PCR，其检测限(limit of detection, LOD)在100-1 000 copies/mL之间波动[6]。并且同样的样品在不同实验室之间Ct值可能存在差异，同一实验室不同试剂和不同检测仪器也可能导致Ct值差异，因此，应当谨慎解读核酸检测报告的Ct值。

2.2 dPCR 数字PCR的核心是通过模板有限稀释、终点扩增和泊松分布的原理来实现绝对定量[7-8]。通过将模板核酸分子分散到数万个以上的反应单元，使每个反应单元分配到1个模板分子或无模板，在每一个反应单元里独立进行PCR扩增，完成之后分析每个反应单元荧光信号，最后根据泊松分布计算目标核酸的拷贝数。按照液体分配方式，dPCR分为微流PCR(microfluidic digital PCR，mdPCR)、液滴PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和芯片PCR(chip digital PCR，cdPCR)3种类型[3]。dPCR的主要优势是定量与扩增效率变化无关，无需内对照基因和标准曲线，对样品中抑制扩增的因素耐受，能够对低浓度核酸样品准确定量。因此dPCR报告的病毒载量结果具有广泛的通用性，可信度较高。

为比较实时荧光RT-PCR和数字PCR的检测效率，Suo等[8]采用相同的引物-探针组合和模板，发现针对ORF1ab和N基因的ddPCR可报告范围为10～5×104copies/reaction，而实时荧光RT-PCR的可报告范围为103-107copies/reaction，可见ddPCR的最小检测范围显著低于实时荧光RT-PCR。进一步分析证明ddPCR检测ORF1ab和N基因的检测限分别为2.1 copies/reaction和1.8 copies/reaction，对应的实时荧光RT-PCR检测限则分别为1 039 copies/reaction和873.2 copies/reaction，因此对于低浓度样品，ddPCR比实时荧光RT-PCR敏感500倍。

3 SARS-CoV-2病毒载量数据的临床应用

最初报道SARS-CoV-2感染主要引起肺炎，随着COVID-19病例增多，逐渐建立起对该疾病临床表现和症状的全面认识。除呼吸道外，陆续从其它样品如粪便、尿液、血液、唾液等检测出病毒RNA[1-2,9]。因此全面了解感染后SARS-CoV-2在宿主不同部位的分布及随着疾病进展发生的动态变化，对于阐明疾病发生机制、评估治疗效果和预测疾病转归等方面，具有重要参考价值。

3.1 不同类型样品病毒分布、载量差异 在SARS-CoV-2被确认为引起COVID-19的病原之后，对于这种全新的冠状病毒病，参照过去对严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)和中东呼吸综合征(Middle East Respiratory Syndrome, MERS)的认识，呼吸道样品成为实验室确诊的首选。但在呼吸道样品之外，其它哪些部位还可能检测到病毒成分，是否可能存在其它传播途径，需实验室证据。

中国疾病预防控制中心团队在2020年3月首先报告了对部分中国患者的观察结果[9]。根据对来自湖北、山东、北京3家医院205名患者1 070份样品(咽拭子、鼻拭子、血液、痰、粪便、尿液等)的检测，发现肺泡灌洗液阳性率最高(93%)，其次为痰(72%)、鼻拭子(63%)、纤维支气管镜活检(46%)、咽拭子(32%)、粪便(29%)、血液(1%)，72份尿液未检测到病毒RNA。除了鼻拭子平均Ct值为24.3(1.4×106copies/mL)，其余样品的平均Ct值大于30(<2.6×104copies/mL)。上述结果，不仅证明了多种样品可以检测到SARS-CoV-2病毒成分，下呼吸道样品阳性率最高，而且从粪便样品中分离到活病毒，表明病毒可能通过粪便途径传播，为疫情初期病例确诊和遏制病毒传播提供了重要信息。确定宿主不同样品病毒载量及持续时间，还有助于研判病毒感染对不同组织产生的病理损害。类似地，美国哈佛大学团队[10]调查了88名住院患者，发现住院患者中首次采样时大多数能够检出病毒RNA，检出率分别为鼻咽拭子50%、口咽拭子67%、痰85%、血液27%、尿液10%。血浆中病毒载量范围为1.8～3.8 log10RNA copies/mL，低于痰中病毒载量(1.8～9.0 log10RNA copies/mL)。

3.2 病毒载量的动态变化 对于确诊感染者来说，连续检测不同阶段、不同类型样品病毒载量可以反映病毒在宿主体内的活跃复制程度，进而动态监测临床进程、评估治疗方案、调整感染者隔离时间。

Zheng等[11]系统调查了浙江省96名COVID-19患者共计3 497份样品(包括呼吸道、粪便、血清、尿液)中的病毒载量，研究发现所有患者呼吸道样品均检出病毒，59%患者的粪便样品和41%患者的血清样品检出病毒，而尿液样品仅1份阳性。呼吸道样品病毒载量最高，其次为粪便和血清样品。轻症患者呼吸道样品在发病第二周病毒载量达到高峰；重症患者呼吸道样品病毒载量在发病后第3～4周仍然较高，其粪便样品同样在发病后第3～4周病毒载量最高。病毒在粪便中持续时间中位数为22 d, 显著高于呼吸道样品(18 d)和血清样品(16 d)，提示疫情防控中需要加强患者粪便管理。

韩国团队[12]采集了54名住院患者的上呼吸道样品(鼻咽拭子、口咽拭子)、下呼吸道样品(痰液)，连续观察了从发病前6 d到发病后48 d病毒载量。症状出现前0～5 d可发现病毒快速增殖，出现症状当天病毒载量最高，相应的Ct值为最低13.47(11.85～16.13)。发病前5d到发病后10 d平均Ct值都<30，发病3周后实时荧光RT-PCR阴性(Ct>35)。相关结果对于大流行期间指导流行病学调查、病房周转、患者随访具有参考价值。总的说来，综合当前已发表的文献，病毒载量变化的总体趋势是，出现症状之前2～3 d可检测到病毒RNA，出现症状第1周达到高峰，随后数天或数周内病毒载量逐渐下降[13]。

3.3 病毒载量与疾病严重程度 SARS-CoV-2感染后，由于宿主免疫状态差异、基础疾病、感染剂量不同等，感染者临床表现范围包括无症状、轻症、中度、重症甚至死亡。病毒载量与患者临床表现之间是否存在相关性，也受到广泛关注。

美国哈佛大学团队[10]分析了235名不同严重程度患者(88例住院患者、94例有症状感染者、53例症状恢复期患者)SARS-CoV-2病毒载量结果，发现住院患者中病毒载量与疾病严重程度存在相关性，需要呼吸机治疗的患者中44%检测到病毒血症，需要鼻插管补充氧气的患者病毒血症检出率为19%，而不需要补充氧气的患者病毒血症检出率为0%。住院患者中，血浆病毒载量越高，与多种炎症和疾病严重程度指标的相关性越显著。

Sun等[14]系统观察了广东省35例COVID-19患者，包括28名轻症患者和7名重症患者。总共收集618份临床样品(包括鼻咽拭子、喉拭子、痰液、粪便、血清)，检测发现重症患者鼻咽拭子和喉拭子中病毒载量高于轻症患者，而两组患者痰液中病毒载量相似。两组患者痰液和轻症患者组粪便中病毒载量高于上呼吸道样品。所有患者上呼吸道中病毒载量在发病后第一周达到高峰，随后2～4周内迅速下降。发病6～8周后仍然能够检出病毒RNA，但病毒载量极低，接近实时荧光RT-PCR的检测限。仅在1名重症患者检测到病毒血症，持续5～6 d。

Chen等[15]采用ddPCR调查了52例COVID-19患者(普通患者40%、重症患者33%和危重患者27%)血液中病毒载量，48例(92.3%)患者可检测到病毒血症。普通患者、重症患者和危重患者血浆中平均病毒载量分别为81.68、73.62和176 copies/mL。30例出院患者中仍有15例血液病毒核酸阳性，轻症患者和重症患者病毒血症中位清除时间均为21 d以上，而危重患者在发病45 d之后仍然可在血浆中检测到病毒核酸。综上，从不同类型样品的检测结果来看，呼吸道样品的病毒载量在不同程度患者中差异不大，而血液、唾液、粪便样品的病毒载量及病毒持续排放时间与疾病严重程度相关[10,15-16]。

3.4 病毒载量与感染性 以实时荧光RT-PCR和数字PCR为基础的病毒核酸检测，不能区分感染性和非感染性病毒，唯有病毒分离培养才能够证实感染性的活病毒的存在。

加拿大团队[17]为了评估SARS-CoV-2的E基因Ct值、发病时间与病毒培养的关联性，将90份阳性样品接种Vero细胞，仅26份(28.9%)样品证实有病毒生长。培养阳性样品的Ct值平均为17，显著低于培养阴性样品Ct值27。出现症状到检测的时间，分离阳性的样品平均为3 d，阴性样品为7 d，而所有Ct>24或症状发作> 8d的样品均无病毒生长，表明不具有感染性。

英国团队[18]对2020年1-5月253名确认感染者324份上呼吸道样品(Ct值均数31.15)进行病毒培养，共133份(41%)样品分离阳性，来自111例感染者。统计分析发现分离阳性与Ct值存在相关性，Ct值每增加1个单位，分离到有感染性病毒的估计比值比(odds ratio，OR)下降0.67。

法国团队[19]从155例患者183份实时荧光RT-PCR阳性样品(9份痰液、174份鼻咽拭子)分离到129个毒株，再次证明了样品Ct值与阳性分离率存在显著相关性。所有Ct值13-17样品都可分离到病毒，Ct值增加，分离率逐渐下降，Ct值33时仅为12%，Ct值>34样品均未见到病毒生长。即使病毒载量高达105RNA copies/mL，发病超过8 d的样品亦不能分离到病毒。可见，通过病毒分离，明确病毒核酸阳性感染者是否具有感染性及其时间区段，对于部署隔离措施、密切接触者追踪、复工复产等公共卫生政策具有参考价值。

3.5 病毒载量与COVID-19预后 无论是无症状感染者或轻症患者，还是住院的重症患者，经过一段时间隔离或治疗之后，大部分患者体内病毒逐渐消失直至完全康复，少部分患者则死于COVID-19。除去如抗病毒药物、基础疾病、年龄等因素之外，感染者的病毒载量是否与疾病的预后相关，同样受到研究者的关注。

首先，有研究探讨了患者入院时病毒载量与COVID-19预后的关联性。Choudhuri等[20]回顾总结分析了2020年美国一家医院近半年时间(3-8月)入院48 h内SARS-CoV-2阳性病例共1 044例(存活出院病例774例，死亡病例270例)，按照Ct值将上述病例分为4组(<22.9，23～27.3，27.4～32.8，>32.9)，结果发现Ct值<22.9组死亡率41.4%，而Ct值>32.9组死亡率13.2%，且存活病例入院时平均Ct值(28.6±5.8)高于死亡病例(24.8±6.0)，因此认为患者入院时Ct值与死亡率相关。Bryan等[21]对华盛顿大学医院245名患者(住院患者194例、急诊39例、门诊12例)资料的分析，在调整了血清学状态、年龄、性别之后，发现入院时病毒载量与死亡相关，与入院时病毒载量较低患者(Ct值>22)相比，入院时病毒载量较高(Ct值<22)患者的OR为4.20(95%CI, 1.62～10.86)。类似地，巴西团队[22]回顾总结了875例患者(包括不用住院的轻症患者50.1%、入院治疗的中度患者30.4%、危重病房收治患者19.5%)，发现高病毒载量(Ct值<25)患者死亡率46%(87/191)，低病毒载量患者死亡率22%(41/185)，同样显示入院时病毒载量与死亡相关，OR值为2.93(95%CI:1.87-4.60)。

随后有研究发现，患者血浆中病毒RNA水平与COVID-19预后也存在关联性。由于未能在血液中检测到病毒颗粒或分离培养出活的有感染性病毒，将血液中检测到病毒RNA定义为RNA血症(RNAemia)，以示与病毒血症(viremia)区别。Prebensen等[23]对挪威部分患者的分析，123名患者中47%至少在1份血液样品中检出RNA血症，入住危重病房或死亡的患者检出率(80%)显著高于普通住院患者(34%)。41%的患者进入危重病房之前RNA血症Ct值>38，低于2.70 log10copies/mL的定量检测限。一例持续阳性的危重症患者最低Ct值为25.9(相当于RNA载量6.3 log10copies/mL)。回归分析显示，患者基线RNA血症和RNA载量与进入危重病房和/或死亡显著相关。相反，入院时上呼吸道拭子Ct值不能提供预后信息。Veyer等[24]采集了法国巴黎一家医院58名患者和12名健康对照者样品，通过dPCR平台检测发病8～12 d后患者血液中病毒载量，发现58名患者中43例(74.1%)出现RNA血症，轻中度患者53%出现病毒血症，重症患者为88%。总的说来，RNA血症水平与疾病严重程度相关，轻中度、重症、危重患者组RNA血症中位数分别为89、279和301 copies/mL。尤其是1名RNA血症载量达到65 476 copies/mL的患者，在采集了血浆样品后第2 d即死亡。因此认为通过数字PCR检测RNA血症是COVID-19患者的可靠预后生物标志。

4 小结与展望

COVID-19全球大流行尚未终结，在过去的一年里全世界科学家不断创新和通力合作，及时总结和分享了疾病有关的实验室指标、临床表现和治疗信息，不断完善COVID-19的疾病“拼图”，为深入认识COVID-19疾病特征、完善预防策略、优化治疗方案进行了不懈的努力。可以预见，在疫情全面消退之前的相当长一段时期，SARS-CoV-2核酸检测依然是患者确诊和治疗管理、密切接触者追踪的重要组成部分。为充分利用核酸检测中获得的病毒载量数据，更加科学地应对大流行疫情，需要考虑以下几个方面：1)核酸检测报告应提供Ct值或病毒载量。虽然定性报告SARS-CoV-2核酸检测阳性或阴性结果足以辅助临床医生做出诊断，但提供相应Ct值或病毒载量将有助于实施更加妥善的临床治疗方案和进行科学的患者管理。2)利用人类内对照基因对Ct值进行标化。由于绝大多数检测是以Ct值反映病毒载量，如前所述，患者样品的Ct值可能受到多种因素影响，因此对原始数据应谨慎解读。在测定病毒载量的同时，设立人类基因内对照将Ct值进行标化，能够消除部分干扰因素，使不同实验条件下的Ct值更加具有可比性。按照标化后的Ct值对患者进行分层分析，能够更加清晰地揭示病毒载量与临床表现、预后的相关性。3)病毒载量与感染性。所有SARS-CoV-2核酸检测结果反映的都是病毒基因组RNA或片段，核酸检测阳性并不意味着宿主体内一定存在复制活跃的有感染性的病毒，只有病毒分离培养才能显示样品中是否存在活的可培养病毒，体现样品的感染性。4)推广开展数字PCR检测。相对于实时荧光RT-PCR，数字PCR更加敏感和准确，因此利用数字PCR可提高血液、眼泪、尿液等低病毒载量样品的检出率，从而可以更加精细地揭示SARS-CoV-2在体内的动态变化规律和致病机制，并且数字PCR亦有助于不同实验室间病毒载量数据交流比较。随着数字PCR仪器设备的普及推广，数字PCR技术必将越来越多地应用于病毒载量检测。

利益冲突：无