相思子毒素结构特征、毒作用机制、检测及其中毒防治研究进展

彭静怡，刘广超，柴立辉，乔春霞

（1.抗体药物开发技术国家地方联合工程实验室，河南大学第一附属医院，河南大学基础医学院，河南 开封 475004；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

相思子毒素（abrin）是从豆科、相思子属植物相思子（AbrusprecatoriusL.）种子中提取的能抑制细胞蛋白合成的毒蛋白。相思子毒素与蓖麻毒素（ricin）相似，同属于Ⅱ型核糖体失活蛋白（ribosomeinactivating proteins，RIP）家族。由于来源广、细胞毒性强且缺乏有效的解毒剂，相思子毒素被美国疾病控制中心定义为B类生物战剂［1］。相思子毒素能通过摄入和吸入等多种方式进入体内，中毒后通常经过数小时甚至数天的潜伏期才出现中毒综合征。误食相思子的种子可能导致胃肠道症状和血管渗漏，引发全身中毒乃至死亡。中毒表现为黏膜发绀、视网膜出血、食欲不振、吞咽困难、呕吐、腹泻、血痢、腹部痉挛性疼痛、血尿、少尿、定向障碍、惊厥和循环衰竭等症状，死亡原因通常为多器官衰竭，目前临床上主要治疗方式是支持性护理［2］。与蓖麻毒素相比，相思子毒素毒性更强，毒力是蓖麻毒素的70倍以上。相思子毒素的小鼠LD50值约为0.04 μg·kg-1，成年人摄入的致死剂量为5.0～7.0 μg·kg-1［3］。

此外，由于相思子毒素具有使核糖体RNA脱嘌呤从而抑制蛋白质合成的能力，使其被考虑用作靶向药物的载体。研究者试图将相思子毒素偶联在抗体等靶向药物上，作为靶向癌细胞的免疫毒素运送至肿瘤部位后发挥细胞杀伤作用［4］。相思子毒素自身也具有增强机体抗肿瘤免疫的能力。早在2006年，Ramnath等［5］就发现相思子毒素可刺激脾和胸腺淋巴细胞的有丝分裂，即使是无毒或亚致死剂量的相思子毒素也能使正常或荷瘤小鼠脾NK细胞的活性增加，从而杀伤肿瘤细胞；且抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用出现时间也明显提前。本文综述相思子毒素结构特征、毒作用机制、检测及其中毒防治策略的研究进展。

1 结构特征和毒作用机制

1.1 结构特征

相思子毒素是一种异二聚体蛋白质，由具有N-糖苷酶活性的A链和半乳糖特异性的凝集素B链组成［6-7］。相思子毒素有a，b，c和d 4个亚型，相对分子质量介于（6.3～6.7）×104之间。其中a和d亚型毒性强，而b和c亚型的B链凝集素活性低，因而仅有较低的细胞毒性［8］。相思子毒素的A链相对分子质量为3.0×104，能不可逆转地作用于哺乳动物60S核糖体大亚基的28S核糖体RNA，使其保守的α肌氨酸环的4324位核苷酸脱嘌呤，导致核糖体失活并抑制蛋白质合成，从而引起细胞凋亡［9-12］。其晶体结构显示A链由3个结构域组成，活性中心由这3个结构域围成的裂口构成，其中活性位点包括Y74，V75，Y113，E164和 R167等残基［13］。相思子毒素 B链是一种含268个氨基酸残基的凝集素，结合细胞表面β-D-半乳糖苷部分，由2个球形结构域组成，每个结构域都包含1个结合位点。相思子毒素的凝集素链与细胞表面β-D-半乳糖苷部分结合后，部分相思子毒素通过包膜内化方式入胞，入胞的毒素少数被转运至胞质溶胶中，通过抑制蛋白质合成促进细胞死亡，而其他部分则被转运至溶酶体降解或循环回细胞表面［14］。

1.2 毒作用机制

在不同细胞中，相思子毒素诱导细胞死亡的途径并不相同。早期研究发现，其通过抑制蛋白质合成，导致活性氧生成增加和线粒体膜电位丢失从而引起线粒体应激，启动胱天蛋白酶3，最终导致DNA断裂，且经该毒素处理的Jurkat细胞中Fas-L、Fas-R和胱天蛋白酶8等死亡受体因子表达增加［10-11］。同时有研究表明，在不同细胞模型中，相思子毒素引起的细胞凋亡程序并不相同。如Bora等［15］研究表明，相思子毒素诱导的人B细胞系U266B1细胞凋亡并不依赖胱天蛋白酶途径，而涉及溶酶体膜通透性的改变以及溶酶体中组织蛋白酶的释放。此外，相思子毒素也可通过与抗氧化肽1（antioxidant peptide-1，AOP-1）相互作用，减弱AOP-1的抗氧化活性，从而引起线粒体应激，并进一步激活胱天蛋白酶3和9，最终导致细胞凋亡［16］。近期的研究还显示，相思子毒素作用于Jurkat细胞后，会引起蛋白质合成抑制（protein synthesis inhibition，PSI）介导的内质网应激，最终诱导细胞凋亡［17］。

为研究相思子毒素介导的细胞凋亡与PSI的依从关系，Tiwari等［18］利用定点突变设计了酶活性降低约95%的相思子毒素A链突变体（R167L），结合蓖麻毒素B链形成了重组毒素。用野生型和突变型毒素分别处理KB细胞和Ovcar-3细胞后，细胞的凋亡动力学与毒素的PSI活性在不同细胞中具有明显差异。在KB细胞中，两者引起细胞凋亡的能力一致，不受突变型毒素PSI弱的影响；而在Ovcar-3细胞中，突变型毒素较野生型引起细胞凋亡的能力明显减弱，提示该细胞中，毒素的PSI可能与凋亡作用相关。早期研究也表明，KB细胞中脑酸溶性蛋白1（brain acid soluble protein-1，BASP-1）蛋白能使大量游离的相思子毒素A链被隔离到细胞核中，而仅在Ovcar-3细胞质中发现游离的相思子毒素A链，证实了核隔离的A链直接介导的DNA损伤可能参与了KB细胞凋亡［19］。

2 检测

从毒素快速侦检这一角度来看，抗体的研发尤为重要，由于毒素与能通过PCR等手段特异性扩增核酸序列的细菌和病毒类病原体不同，其通常利用基于抗原抗体反应的免疫学检测方法进行诊断。2008年，Garber等［20］用兔抗相思子毒素多克隆抗体和鼠抗相思子毒素单克隆抗体建立了酶联免疫吸附（ELISA）和电化学发光（ECL）检测法，在果汁、奶制品或调料中，相思子毒素的最低检出限能达到0.1～0.5 μg·L-1。Zhou 等［21］通过类似的方法建立了以单克隆抗体为捕获抗体，兔多克隆抗血清为检测抗体的双夹心ELISA法，在复杂环境中该方法的检出限也可达到0.5 μg·L-1，且回收率均能达到约95%。2011年，Li等［22］用甲醛溶液处理的相思子毒素免疫小鼠，经细胞融合和筛选获得了3株分泌特异性抗相思子毒素抗体（4G1，1G5和3C2）的杂交瘤细胞。其中，4G1是针对A链的抗体，1G5和3C2是针对B链的抗体。基于3C2与4G1建立的ELISA法灵敏度高，检测限为7.8 μg·L-1。

2017年，He等［23］也通过杂交瘤细胞的方式筛选出7株抗相思子毒素单克隆抗体Abrin 1～7，其中Abrin-1和-2与相思子毒素A链结合，Abrin-3，-5～-7与相思子毒素B链结合。选择B链特异性的Abrin-3为捕获抗体，A链特异性的Abrin-2为检测抗体，建立了一种能检测相思子毒素全毒素及其亚型混合物的双夹心ELISA法。该法灵敏度高，特异性强，能在磷酸盐缓冲盐水和牛奶等复杂背景中检测到相思子毒素最低浓度1 μg·L-1。同年，Tam 等［24］也报道了一组针对相思子毒素A链及B链全毒素的相思子毒素特异性单克隆抗体，以此建立了双夹心ELISA，评估并优化最佳配对抗体后最低检出限为1 μg·L-1，且与其他RIP无交叉反应。

Hansbauer等［25］报道了一种基于快速质谱的相思子毒素检测方法，利用偶联有多种相思子毒素特异性抗体的磁珠，在复杂的待测样品中分别结合相思子毒素特异性肽段，可灵敏地分辨各亚型毒素。更重要的是，可通过四极轨高分辨率仪器的平行反应监测模式实现多重、灵敏和可再生的定量分析。2018年，Isenberg等［26］开发了一种能同时定量检测血液中蓖麻毒素和相思子毒素的诊断方法，通过同位素稀释、固相萃取和蛋白质沉淀处理后，通过液相色谱-串联质谱能检测5～500 μg·L-1相思子毒素和0.3～300 μg·L-1蓖麻毒素，其质控样品测定的相对误差＜10%，相对标准偏差＜19%，尤为适合蓖麻毒素和相思子毒素暴露的快速诊断。

核酸适配体是一种短的单链DNA或RNA寡核苷酸，能高亲和力、高特异性地与靶标结合，核酸适配体易于合成、稳定、灵敏度高等特点使其成为多种毒素检测的新方法。Tang等［27］通过体外亲和色谱法从一个非常大的核酸序列目标库中筛选出与相思子毒素亲和力最高的单链DNA适配体，荧光偏振法测定其解离常数为（28±9）nmol·L-1，且该适配体的结合具有特异性；随后该团队利用分子光开关试剂［Ru（phen）2（dppz）］2+，建立了一种基于核酸适配体的相思子毒素直接检测方法，不需要标记该核酸适配体，操作简单，灵敏度高，可在低至1 nm的波长范围内直接检测相思子毒素。该测定不仅可以在生理缓冲液中进行，也可在更复杂的生物基质如稀释的血清中进行，且具有较高的选择性。

3 中毒防治

早在数百年前人们便知道，给小牛投喂少量的相思子种子，可以保护小牛抵御相思子毒素中毒。Ehrlich［28］采用类似的方法对小鼠进行了免疫接种，继而又通过皮下注射毒素进行免疫，最终使动物产生高滴度抗毒素抗体。保护性抗体可通过血液从母牛传递给子代，在其分泌的牛奶中也能检测到。

3.1 主动免疫

目前，针对相思子毒素的生物防护疫苗较少，主要有全分子毒素疫苗、A链［29］或B链［30］疫苗等。Griffiths等［31］报道，甲醛溶液灭活的毒素能有效保护小鼠免受天然相思子毒素的侵害。但由于此类制剂仍残存毒性，不能进一步推广应用［32］。以亚致死剂量相思子毒素或减毒后毒素免疫小鼠，也可在体内诱导出保护性抗体；同时，为增进局部呼吸道黏膜免疫，可将毒素以脂质体微囊化方式处理，既可有效减轻肺部损伤，又可提供至少1年的全身和局部免疫，可减少抗原使用量和接种次数［3，33］。

其实，研究者们对于AB型毒素的A链还是B链更适合做疫苗尚有争议。许多研究者认为，B链较A链免疫原性差，不能产生良好的免疫保护作用［32，34-35］；但也有研究者认为，即使B链无毒，产生的抗B链抗体亦能保护机体免遭毒素攻击［36-37］。Han等［32］使用定点诱变的方式突变了相思子毒素A链的2个关键氨基酸残基Glu164和Arg167，构建了突变体mABRAE164A/R167L并在大肠杆菌中表达，从而获得了毒性显著降低但抗原性和免疫原性保持不变的毒素，并对BALB/c小鼠进行了3次免疫，用10倍LD50剂量的天然相思子毒素攻毒。结果显示，突变毒素能产生100%保护作用；此外，免疫小鼠的血清也能为未免疫小鼠提供被动保护。同年，该研究团队将相思子毒素A链突变体mABRAE164A/R167L与蓖麻毒素A链突变体mRICAD75A/V76M/Y80A相连，成功构建表达并获得了二价候选疫苗，该疫苗免疫小鼠后能抵抗6倍LD50剂量的天然相思子毒素和蓖麻毒素混合毒素的攻击［38］。2014年，Zhang等［39］筛选出了2个可溶性表达、免疫原性良好且无毒的相思子毒素A链截短体（truncated abrin toxin A chain，tATA）1和tATA4，并通过鼻腔滴注（intranasal instillation）、ig和sc给药方式分别免疫小鼠，发现各组小鼠血清中的抗体滴度均为阳性，且tATA4诱导的保护效果较tATA1更好，这可能与相思子毒素A链的核心螺旋结构被截断有关。当以SPO1作为佐剂sc给药时，tATA4可诱导高滴度的抗体，完全保护小鼠抵抗40倍LD50剂量毒素的攻击。2017年，Tiwari等［40］研究表明，对蛋白质免疫优势区域的了解有助于设计出更有效的疫苗。他们基于前人的研究设计了一种相思子毒素A链和与相思子毒素同源的相思子凝集素重组的嵌合结构，其中包含结合中和抗体所需的最小必须折叠域，同时对其免疫原性进行表征。细胞学实验发现，与全长相思子毒素A链比较，该嵌合体的毒性较某些突变体相思子毒素的毒性弱。该团队将嵌合体作为免疫原免疫BALB/c小鼠，发现用45倍LD50剂量相思子毒素攻毒时，小鼠仍能100%存活，且被动免疫研究中也有相同的保护效果。该研究认为结构域特异性的嵌合体蛋白作为潜在的疫苗候选物能引发更高比率的中和抗体。

B链疫苗研究方面，王俊虹等［41］认为在缺乏A链情况下B链无毒，更适合开发为疫苗。2016年，他们利用密码子优化软件Condonopt对B链进行基因优化，替换大肠杆菌稀有密码子为高频密码子，成功构建原核表达载体pQE80L-ATB，并采用Ni-NTA亲和色谱纯化获得了蛋白纯度＞97%的重组B链蛋白（recombinant abrin toxin B chain，rATB）。Western印迹实验结果表明，目的蛋白能够特异性被抗天然相思子毒素多克隆抗体识别，细胞毒性试验结果也表明该蛋白无毒。随即他们通过ip给予rATB免疫小鼠，免疫后的小鼠可抵抗最高剂量为5倍LD50剂量的天然毒素，且保护率均为100%。此外组织学研究表明，用rATB免疫小鼠能降低毒素相关的组织损伤程度，提示B链蛋白作为候选疫苗可有效预防相思子毒素中毒。该研究也奠定了B链作为疫苗研发靶点的基础［42］。此外，他们还构建了一种含有蓖麻毒素B链和相思子毒素B链的双重联合疫苗，命名为RTB-ATB，用其免疫小鼠后可诱导同时中和这2种毒素的特异性抗体［43］。

3.2 被动免疫

除了疫苗，能发挥中和保护效应的抗体也是解决毒素中毒的良好策略。为获得能中和相思子毒素的抗体，Surendranath 等［34］通过内酰胺-琼脂糖亲和色谱纯化了相思子毒素A链和凝集素，构建了重组相思子毒素A链（recombinant abrin A chain，rABA）蛋白并免疫小鼠。利用杂交瘤技术筛到了4株能结合天然相思子毒素和rABA的IgG单克隆类抗体。其中，D6F10结合能力最高，在天然和变性条件下均可特异性识别相思子毒素及rABA，且不与其他RIP类蛋白交叉结合。在Jurkat，MCF-7和Ovcar-3细胞模型中，D6F10均能起到保护作用且保护效应存在浓度依赖性。此外，研究者还利用BALB/c小鼠证实了D6F10的体内保护效应，使之成为首个针对相思子毒素的中和性抗体。Bagaria等［44］进一步构建了系列相思子毒素A链截短体，并经突变分析确定D6F10识别的表位是位于相思子毒素A链的活性位点中心附近的Thr112，Gly114和Arg118残基，因此可以阻断体外无细胞蛋白合成体系中相思子毒素A链的活性，抑制相思子毒素的PSI作用。此外，他们通过共聚焦显微镜观察到与相思子毒素结合的D6F10抗体存在内化现象。由于该抗体的中和活性良好，推测D6F10抗体可能干扰了相思子毒素在胞内的输运，或通过物理性封闭毒素的毒性位点，从而直接阻断其催化活性。

Kumar等［45］利用类似方法构建了重组嵌合蛋白rABA，免疫小鼠后获得杂交瘤细胞，并筛选出能抑制相思子毒素介导的细胞凋亡的单克隆抗体A7C4。该抗体预防给药能保护小鼠免遭毒素攻击。与D6F10不同的是，A7C4结合相思子毒素的表位位于 A 链 Thr82，Gln83，His85，Asp103和 His105残基，距离相思子毒素的活性中心较远，这与无细胞体系中A7C4不能阻断相思子毒素A链抑制荧光素酶合成的结果相符。此外，研究者通过共聚焦显微镜分析发现，A7C4并不能抑制相思子毒素在细胞表面附着，而是与D6F10一样随相思子毒素A链入胞而被内化。因此认为可能存在其他胞内中和机制抑制细胞或小鼠体内的相思子毒素。

2018年，Mechaly等［46］用亚致死剂量相思子毒素免疫家兔后获得高亲和力的抗相思子毒素血清，以此构建单链抗体噬菌体展示库，分离出一组高亲和力的抗相思子毒素特异性抗体（针对相思子毒素A链和B链的分别为6个和4个），这些抗体针对相思子毒素表面的5个不同表位，且可同时结合毒素。此外，当用这些抗体对暴露于致死剂量相思子毒素后6 h的小鼠进行被动免疫时发现，RB9，RB10，RB28和RB30这4个抗体能保护85%～95%小鼠免于死亡。

4 结语

相思子毒素作为B类生物战剂，来源广泛，易误服，制备简单，毒性极强，是我国生物防控领域的重要研究对象。相思子毒素能通过激活多种信号通路促进细胞凋亡，可以此为靶点设计免疫毒素靶向癌细胞，因此对其致病机制的研究很重要。在复杂环境中对相思子毒素进行快速检测应用广泛，因此如何提高检测方法的灵敏度、避免出现假阴性具有重大意义。同时，国内目前针对相思子毒素的抗体等特异性解毒剂的研发报道较少。本课题组通过对筛选出的相思子毒素鼠源单克隆抗体进行人源化改造获得了1株有良好中和保护作用的人源化单抗，小鼠中毒6～9 h后抗体保护率仍＞50%。可以预见，包括该候选抗体在内的进一步开发和应用将会增强我国生物安全防控力量，为相思子毒素中毒提供应急救治策略。