血栓动物模型的制备方法

王洋综述，吴伟春审校

血栓是心血管系统内血液成分形成的固体质块。血栓形成是一个复杂的过程，主要由于凝血功能紊乱所导致。在正常生理状态下，血液中的凝血系统和抗凝血系统相互拮抗，保持动态平衡，当这种平衡被打破时即可形成血栓[1]。血栓动物模型的制备是根据血栓形成所需的条件和原理来进行的。模型制备的首要考虑因素是实验动物的选择，常用动物包括羊、猪、犬、兔子、大鼠以及小鼠等，其中血栓动物模型最常使用的是大鼠和小鼠。其次就是实验部位的选择：对于血管内血栓模型而言，实验室多选用颈动脉、股动脉、腹主动脉、尾动脉、股静脉、下腔静脉及大脑中动脉等；对于心腔内血栓而言，左心室血栓较为常见。

1 血管内血栓动物模型的制备

血管内血栓动物模型主要包括动脉血栓和静脉血栓[2]，其制备方法大致可以分为物理损伤法和化学损伤法两种类型。

1.1 物理损伤法

物理损伤法是指通过一些损伤性方法破坏血管内膜，使内皮下胶原纤维暴露，从而激活血小板且释放多种生物活性物质，最终启动内源性和外源性凝血途径导致血栓形成。下面就将常见的几种模型制备方法作一简单介绍。

机械损伤法：在静脉血管及动脉血管中均适用。用刮匙、银针等器械损伤血管内膜，暴露内皮下基质，然后血小板活化，出现血小板聚集及释放等反应，最终形成血小板血栓。此方法应该注意的是血管内膜的破坏要达到一定深度，通常数毫米不等。

异物法：在静脉血管及动脉血管中均适用。在血管腔内放置聚乙烯管、丝线或者钢丝圈等异物，这些异物不仅可以损伤血管内膜激活凝血途径，还可以改变血流状态，使血流紊乱，利于血栓形成，但是形成的血栓大部分是在异物上附着形成。有学者描述了大鼠动脉-静脉旁路血栓形成模型[3]，首先分离出大鼠的左侧颈动脉及右侧颈静脉，在两侧血管之间连接长约7.5 cm 的导管形成旁路，导管内含有丝线，血液循环一段时间后丝线上可以形成血栓。

结扎法：在静脉血管及动脉血管中均适用。根据不同的动物类型及实验目的，选择结扎的血管也各不相同，常被选择结扎的静脉血管包括下腔静脉、髂静脉和股静脉等。结扎法操作简单、重复性好，方法是使用丝线结扎目标血管或者使用镊子或银针等钳夹目标血管数小时，目的是使局部血流淤滞、阻断，导致内皮细胞损伤从而启动内源性凝血途径导致血栓形成。有学者在大鼠或小鼠麻醉后经腹中线解剖，钝性分离下腔静脉，然后用不可吸收7-0聚乙烯缝合线结扎下腔静脉而形成血栓[4]。

电流损伤法：在静脉血管及动脉血管中均适用。Diaz 等[5]将镀银的铜线连接到一根25 号针上，将其插入皮下组织和下腔静脉远心端，然后施加250 μA 的直流电约15 min 即可通过促进氧自由基形成而造成内皮细胞损伤。

低温加压损伤法：主要利用低温及加压状态下血流速度减慢的原理，同时血管内膜也可发生损伤，最终使血栓形成。这种方法操作简单，容易形成血栓。

1.2 化学损伤法

化学损伤法是指使用一些特殊化学试剂（三氯化铁、角叉菜胶、月桂酸钠、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、过氧化氢等）后使内膜受损而形成血栓，不同化学物质作用最后形成的血栓成分也稍有差异。其中最常用的是三氯化铁血栓形成法，此方法操作简单、重复性好，最终形成的血栓结构接近于人类自发形成的血栓结构，对进一步的溶栓等研究有着显著的意义。Huttinger 等[6]用此方法制备了颈动脉的血栓模型，首先将胶带切成5.5 cm 的长度，将其浸泡在50%的氯化铁溶液中一周备用，然后手术分离出犬的颈动脉、用纱布擦干动脉暴露区域，最后将浸泡了一周的胶带缠绕在暴露的颈动脉周围以形成血栓。研究表明不同浓度的三氯化铁溶液导致血栓形成的时间不同。有文献报道在一定浓度范围内，三氯化铁的浓度越高，最后血栓形成的时间会越短；除此之外，不同外敷时间窗最后形成的血栓大小也不尽相同，所以可以据规律制造不同规格大小的血栓（占据血管腔不同的比例）以满足不同研究目的的需要[7-10]。截止到目前为止，通过含有三氯化铁溶液的滤纸外敷血管使血栓形成的机制仍不完全清楚，可能是三氯化铁用于血管表面后参与了活性氧生成，然后触发血管壁损伤和内皮剥脱。也有学者联合使用三氯化铁溶液及凝血酶诱导脑血管内血栓形成[11]，这种方法更贴近于疾病的发病机制及病理生理学改变。

除此之外，光化学法也属于化学损伤法范畴。该方法是在冷光源照射下通过改变血流状态从而形成血栓，最大的优点是避免了对血管的机械损伤、能够快速形成血栓，并且形成血栓的原理也更接近于临床上血栓的发生机制，常用于脑血管疾病的模型制备；也有学者在血管内注射光敏感物质的基础上使用特殊光线照射，通过破坏内皮细胞而形成血栓。Eitzman 等[12]介绍了通过光化学法形成颈内静脉血栓的方法。具体步骤是将小鼠麻醉后仰卧于显微镜下，解剖游离出颈内静脉，然后通过尾静脉注射磷酸盐缓冲液稀释的色素玫瑰红（RB）试剂，在注射之前用1.5 mW 的绿色激光（540 nm）照射游离出来的颈内静脉区域，直至形成血栓。玫瑰红试剂可以积聚于内皮细胞的脂质双分子层中，在光照射下会发生光化学反应，导致氧自由基形成从而对内皮造成损害，但是需要注意的是，色素玫瑰红试剂对动物可能有毒性作用。

2 心腔内血栓动物模型的制备

既往人们常常关注于血管内血栓模型的建立，鲜少关注心腔内血栓模型，就心腔内血栓动物模型而言，目前国内尚未见相关文献报道，而国外有少数学者已经提出心腔内血栓模型的制备方法，总结这些模型也是紧紧围绕血栓形成的三个条件制备的，即心血管内皮细胞的损伤、血流状态的改变以及血液凝固性增高。

2.1 心血管内皮细胞损伤

血管内皮细胞损伤以后通过释放多种凝血因子最终启动内源性和外源性凝血途径[13]，是血栓形成最重要和最常见的原因，也是唯一能单独引起血栓形成的因素。众所周知射频消融所产生的高热量可使内皮细胞损伤，故通过射频消融也可制造心室、心房血栓[14]。具体方法是将电极导管经静脉或动脉血管送入心腔的特定部位，然后通过释放射频电流导致心内膜损伤。损失部位可激活凝血途径导致血栓形成。有研究表明射频消融所致的病变面积越大，血栓的发生率就越高。而且病灶面积、深度、体积与血栓体积呈显著正相关。但是据报道这种方法所致的血栓大小不易控制，而且容易出现栓塞事件。

2.2 血流状态的改变

血流状态的改变主要是由于血流缓慢或者涡流状态、短暂性的血液停滞、血管受压或者血液本身的黏性较大等原因，这也是静脉血栓比动脉血栓发生率高的原因。低流量心脏状态与心内血栓形成息息相关，而心脏骤停被认为是最终的低血流状态。所以已有学者进行了这方面的探索[15]，方法是利用猪心脏骤停模型形成左心室血栓。首先进行心室颤动诱导，一旦血流停止，6 min 内即可出现血栓，成功率较高，但是研究表明这种方法形成的急性血栓在早期除颤或胸外按压几分钟后就会溶解，并不稳定。另外，这种方法是由于心肌功能障碍导致血液淤滞而形成血栓的，所以一旦功能恢复就可能导致栓塞。

而目前文献报道较为常见的心腔内血栓模型制备方法是在心肌梗死的模型基础上注入止血剂，然后制备心腔内血栓或者附壁血栓。例如Hamilton等[16]提出的左心室血栓的制备方法，实验动物是20～30 kg 的犬，在动物麻醉并开胸后，首先结扎心尖冠状动脉使心尖心肌梗死，再通过注射纤维蛋白黏合剂核心，使其周围形成新鲜血栓从而制造左心室的附壁血栓模型。这个实验中涉及的纤维蛋白核心即Hemaseel 纤维蛋白黏合剂，是一种由重构的密封蛋白浓缩物和重构的凝血酶制成的止血剂。此方法操作稍微复杂，不仅需要先制作心肌梗死模型，而且注入左心室的纤维蛋白核心也需要实验室多步骤制备，并且最后形成的血栓由于纤维蛋白核心的影响与临床上常见的新鲜血栓亦有明显区别。除此之外也有学者在冠状动脉心尖段结扎制造心肌梗死模型后，在心内膜处注射5%苯甲酸钠和1 000 单位的凝血酶，最后形成左心室附壁血栓[17]。

2.3 血液凝固性增加

血液凝固性增加主要是指遗传性或者获得性原因所导致的血液高凝状态。有学者利用粒细胞集落刺激因子（G-CSF）诱导血液高凝状态[18]，通过炎症-血栓相互作用使小鼠左心室血栓形成。此方法在腹腔注射G-CSF 大约4 周以后可以观察到左心室血栓形成，模型建立时间较长。

血栓动物模型的成功制备对临床和科研工作有着诸多显著的意义。最常见的是对溶栓药物的评估，还可以对血栓相关疾病进行研究[19-20]。血管内血栓动物模型的制备方法多种多样，在实际应用时应该根据研究的目的和需要选择最为合适的模型制备方法。心腔内血栓的准确诊断在临床上非常重要，常规经胸超声心动图由于声窗等因素的影响对某些特殊部位的血栓难以显示或者难以与心脏肿瘤、赘生物等鉴别，必要时需进行经食道超声心动图检查，但是经食道超声心动图检查会造成大部分患者感到不适。现在有一种比较新型的方法可以简便地探查到心腔内的血栓，这就是使用血栓靶向超声造影剂。这种特殊的造影剂能够与血栓紧密结合，使血栓更容易显示和鉴别。总之，心腔内血栓模型的制备有着重要的意义，为临床和科学研究中有关血栓性疾病的研究提供了重要的基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突