分光光度法测定牛奶中的亚硝酸盐

文│余爱英（河南省郑州种畜场）

一、前言

亚硝酸盐（NO2-）主要在食品保鲜、化肥等方面广泛应用，但目前已成为环境、食品以及生理系统中普遍存在的污染物。过高的亚硝酸盐浓度对人体健康可造成伤害，特别是婴幼儿和孕妇群体，由于人体摄入一定量的亚硝酸盐（NO2-）可发生高铁血红蛋白症，而且亚硝酸盐容易与人体内的仲胺、叔胺和酰胺发生反应，产生具有致癌作用的亚硝胺化合物，为防止上述现象发生，应限制食品中亚硝酸盐的含量，特别是乳及乳制品中亚硝酸盐的含量。

近年来，亚硝酸盐的测定方法主要有分光光度法、色谱法、化学发光法等，基于分光光度法操作简便、成本较低等优点，目前是牛奶中亚硝酸盐测定常用的方法之一。常用的分光光度法主要是基于格里斯试剂比色法，格里斯反应由约翰·彼得·格里斯于1879年首次提出，主要用重氮化反应测定唾液中的硝酸盐。格里斯法用于泌尿生殖道细菌感染的检测已有相当长的时间。格里斯法是亚硝酸盐将芳香伯胺转化为重氮离子，重氮离子随后与另一种芳香化合物偶联生成偶氮燃料。常用的目标胺是磺胺酸、硝基苯胺和对氨基苯乙酮，而苯酚、1-萘酚、1-萘酚-4-磺酸等为偶联剂，无论采用哪种试剂，其都存在样品适应性问题。在GB5009.33—2016中采用的目标胺是对氨基苯磺酸，偶联剂是盐酸萘乙二胺。本文介绍了盐酸萘乙二胺分光广度法检测亚硝酸盐的原理以及检测过程中的注意事项，以期提高分光光度法检测亚硝酸盐的准确度，保证牛奶以及乳制品中亚硝酸盐污染物的有效控制。

二、盐酸萘乙二胺分光光度法主要检测原理

GB5009.33-2016第二法采用的是盐酸萘乙二胺分光光度法，主要检测原理是样品经蛋白质沉淀、脂肪去除后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准品比较定量，测得亚硝酸盐含量。

三、样品提取、过滤澄清原理介绍及注意事项

1.硼砂的作用。在GB5009.33-2016第二法样品亚硝酸的提取过程中，样品中加入硼砂，使亚硝酸盐的总量不会因为加热分解而减少，硼砂的主要作用是吸收亚硝酸盐分解。硼砂溶液呈碱性，碱性条件下，能够有效利用锌盐沉淀蛋白质。另外在碱性条件下，亚硝酸根以离子形式存在，易溶且稳定，如溶液偏酸性，则形成亚硝酸，在加热条件下容易挥发，也易分解，导致提取效果不佳。

2.乙酸锌与亚铁氰化钾沉淀澄清剂。作为沉淀澄清剂，乙酸锌与亚铁氰化钾用来去除牛奶中蛋白质、脂肪等影响亚硝酸盐测定的物质。操作过程中，亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液要严格按照测定方法的量和次序来添加，添加亚铁氰化钾溶液摇匀后再添加乙酸锌溶液，在添加过程中应边摇边添加。

3.过滤。由于分光光度法对样品溶液的澄清度要求较高，但食品基质复杂，牛奶样品经提取并澄清后，脂肪浮于上层，若用滤纸过滤后仍不澄清，样品溶液可经4℃冷冻高速离心后再进行滤纸过滤，滤液能够进一步澄清。

为验证滤液澄清度、提取过程、提取试剂对后续测定的影响，可向滤液中加标，然后测定加标后滤液的亚硝酸盐含量，如果测定值与加标量差异不大，可认为滤液的澄清度、提取过程、提取试剂对后续测定过程无影响。

4.试剂对测定过程的影响。在实际检测工作中发现，不同厂家、不同纯度、不同保质期的试剂会影响加标样品的回收率，在日常检测中应做试剂空白试验，以消除试剂对测定的影响。

5.测定过程中的试验仪器。试验仪器有亚硝酸盐残留或其他物质残留，导致测定结果不准确。有文献指出，洗涤剂残留可影响偶氮化反应，从而影响显色反应及分光光度计测定值。

6.显色反应过程。澄清后的滤液要进行显色反应，然后进行分光光度计测定。显色测定过程中要严格按照反应时间操作，加完每个试剂后，要轻轻摇匀后再加下一个试剂。加完对氨基苯磺酸溶液后要静置3～5分钟，保证重氮化反应充分，所有试剂添加并定容后应在15～60分钟内进行比色。

四、总结

盐酸萘乙二胺分光光度法检测亚硝酸盐主要依据重氮偶合反应进行测定，在测定过程中对重氮偶合反应有影响的因素都会对测定值有影响，如各种试剂、提取澄清过程、试验仪器、显色反应时间等因素，在日常检测过程中应避免这些因素的影响，以提高牛奶中亚硝酸盐测定的准确性。