高通量转录组测序技术在评价子宫内膜容受性中的应用价值

白塔吉，何金英，马玉珍

辅助生殖技术应用于人类已有近40年的历史，是不孕不育患者最有效的治疗方法之一。随着超促排卵方案的优化和体外受精（in vitro fertilization，IVF）、胚胎培养技术的不断改进，胚胎质量显著提高，但是经过IVF-胚胎移植（embroyo transfer，ET）技术助孕的活产率依然是30%～40%，胚胎植入仍然是其成功的限速步骤[1]。

子宫是所有胎生雌性动物必备的重要生殖器官，是胚胎着床以及发育的“土壤”，在胎生动物繁衍后代的过程中发挥重要作用。育龄期女性在月经周期中，子宫内膜分为月经期、增殖期和分泌期，1956年世界卫生组织（WHO）首次提出月经周期的分泌中期（第19～23天）为子宫内膜容受期，在这一时期，进入子宫的囊胚黏附、侵入并诱导内膜间质发生一系列变化，最终植入内膜发育形成胎儿，通常将子宫内膜的这一时期称为胚胎植入窗口期[2]。近10年随着分子生物学技术的发展，将基因表达与子宫内膜组织形态、细胞性质相联系，月经周期子宫内膜基因差异表达的研究通过差异基因表达谱[3-5]得到与子宫内膜容受性相关的基因，并将其制定成特有的子宫内膜容受性微阵列（endometrial receptive microarrays，ERA），能够更加精准地确定个体间子宫内膜容受期。与子宫内膜容受性相关基因表达的研究较多，但研究结果中基因重叠性较低，可能与样本量小、样本可变性和测序技术的局限性相关。高通量转录组测序（high-throughput transcriptome sequencing）是一种强大的基于核苷酸测序的方法，无需预先针对已知序列设计探针，即可对任何生物整体转录活动进行检测，因此应用范围更加广泛。近年来表观遗传水平、转录水平及转录后水平的大量研究证实，高通量转录组测序不仅可以量化月经不同时期子宫内膜基因表达水平的变化、了解基因表达的调控机制，还可以发现和鉴定子宫内膜容受状态的生物标志物[6]。

1 高通量转录组测序

高通量测序技术（high-throughput sequencing technology） 是相对于传统的桑格测序（Sanger sequencing）而言的。高通量测序可以大规模、高通量、高速度、高自动化地对成千上万个基因同时进行研究，并且具有完美的定量功能和低廉的成本，从而克服了传统分子生物学技术复杂、低效等缺陷。该技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。因此，基因组测序技术在医学基础研究和临床诊断、治疗中具有广阔的应用前景[7]。

转录组是揭示细胞及组织中分子组成和解读基因组功能所必需的。高通量转录组测序技术不仅能够在整个转录组中发现、分析和量化RNA表达水平，而且还可以分析非编码RNA序列，结合生物信息学可以更加全面地了解基因表达水平和调控机制[8]。

2 高通量转录组测序技术在子宫内膜容受性中的应用

2.1 可育女性子宫内膜容受期的基因表达 子宫内膜受甾体激素调节发生增殖、分化和脱落周期性变化，虽然子宫内膜容受性在过去几十年中已被广泛研究，但其具体分子机制仍不清楚。目前利用高通量转录组测序技术寻找与子宫内膜容受期相关的基因表达已有许多报道。Altmäe等[9]首次对人类胚胎（n=128）和人类子宫内膜（n=8）进行转录组分析，结合基因功能注释及富集分析发现，整合素、层黏连蛋白、胶原蛋白等细胞黏附分子和炎症反应途径、JAK-STAT信号通路在植入过程中的重要性。还确定了涉及植入过程的细胞因子-细胞因子受体途径，其中骨桥蛋白、白血病抑制因子（LIF）和瘦素途径具有互作调控机制。此外，研究还发现胚胎-子宫内膜相互作用中的许多新蛋白，如载脂蛋白D（APOD）、内皮素1（END1）、成纤维细胞生长因子7（FGF7）和胃泌素（GAST）等。Hu等[10]通过高通量转录组测序技术发现在子宫内膜容受期有2 372个基因差异表达，其中1 099个基因表达上调，1 273个基因表达下调，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western blotting）对其中19个基因进行了符合性验证；利用生物信息学对基因功能进行解析，发现金属硫蛋白（MT）家族7个成员（MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1M、MT1X和MT2A）以及与子宫内膜生理学相关的4种新型转录物（HAP1、ZCCHC12、MRAP2和OVGP1）在胚胎植入过程中发挥重要作用，与上调的矿物质吸收富集途径和下调的细胞周期富集途径相关。同时揭示了5种调节因子GLI2、CDC25A、Toll样受体9（Toll like receptor 9，TLR9）、MT1G和SLC5A1与子宫内膜容受性有关。Altmäe等[11]在子宫内膜转录组生物标志物荟萃分析中发现57个差异表达的基因和调控其功能的348个微小RNA（miRNA），主要通过免疫应答反应、补体级联反应和外泌体途径在调控子宫内膜容受期中发挥作用。Rekker等[12]对可育女性容受前期与容受期子宫内膜进行比较发现，两者存在91个差异表达的miRNA和865个差异表达的mRNA，发现这865个目标mRNA参与了子宫内膜容受期经典的信号传导通路，根据功能评分观察到这些mRNA在糖皮质激素、G蛋白耦联受体、胰岛素样生长因子1（IGF-1）和JAK/STAT信号传导途径中显著上调，而在Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号传导途径中显著下调。目前研究已经确定了许多与胚胎植入相关的生物标志物，包括LIF、骨桥蛋白、胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）、人透明质酸结合蛋白2（HABP2）、肝素结合性表皮生长因子（HB-EGF）、白细胞介素15（IL-15）、孕激素相关子宫内膜蛋白（PAEP）、同源盒基因A10（HOXA10）、空通气孔同源框2（EMX2）、黏蛋白1（MUC1）和集落刺激因子1（CSF-1）等。

2.2 反复植入失败（RIF）患者子宫内膜基因表达 利用辅助生殖技术治疗不孕症的过程中，部分患者通过IVF获得优质胚胎，但是移植后出现胚胎RIF现象。导致RIF的因素包括配子/胚胎因素、子宫因素、免疫因素和血栓形成等，但RIF的确切机制目前仍不明确，已知子宫内膜基质细胞蜕膜化异常是导致RIF的重要原因之一。子宫内膜在雌、孕激素及趋化因子介导下发生蜕膜化，蜕膜化的子宫内膜通过调节免疫细胞、黏附因子、细胞因子、生长因子及趋化因子等，为接受胚胎及介导植入做好充分的准备。近年来，许多研究发现黏附因子在RIF患者容受期子宫内膜样本中异常表达，抑制基质细胞分化、阻碍蜕膜化进程，从而影响胚胎植入[13-15]。细胞因子及其受体相互作用通路在早期胚胎的发育和植入过程中也发挥重要作用。RIF患者子宫内膜中有许多mRNA表达异常，其中表达下调的多数mRNA都涉及细胞因子及其受体相互作用通路[16]。但这些围绕蛋白编码基因的功能研究，不足以解释子宫内膜基质细胞蜕膜化的复杂变化和周期差异。张倩[17]通过高通量转录组测序筛选8例RIF患者与10例行IVF的非RIF女性容受期子宫内膜组织中差异表达的miRNA、长链非编码RNA（lncRNA）和mRNA，共发现差异表达的miRNA 157个（97个上调、60个下调），lncRNA 1 292个（679个上调、613个下调），mRNA 294个（152个上调、142个下调）。并证实RIF患者容受期子宫内膜组织中显著上调的miR-148a-3p和lincARDD1，进一步说明miR-148a-3p可能通过下调HOXC8抑制基质细胞分化，阻碍蜕膜化进程，从而影响胚胎植入，导致胚胎种植失败。而lincARDD1调控的靶基因CSF-1在RIF患者容受期内膜组织中表达上调，造成蜕膜化反应异常，从而导致胚胎种植失败。

3 高通量转录组测序技术在子宫内膜容受性的表观遗传调控机制

3.1 miRNA 其作为重要的转录后调控因子，由于序列短、同源性高，利用基因芯片检测miRNA非常困难，高通量测序技术不但能够克服这一难题，而且能够发现新的miRNA。miRNA在多种生物学过程中具有调控作用，包括细胞增殖、分化和凋亡以及胚胎发育和着床[18]。许多研究通过高通量转录组测序技术发现miR-30b、miR-30d、miR-494和miR-923在子宫内膜容受期特异表达，认为其与胚胎着床密切相关。miR-30b和miR-30d在容受期子宫内膜中显著上调，而miR-494和miR-923下调，这些差异表达的miRNA调控子宫内膜基因表达、细胞增殖和凋亡等过程，并主要参与Wnt/β-catenin、细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）、转化生长因子β（TGF-β）、p53和细胞黏附分子等与胚胎植入相关的途径[19]。Rekker等[12]比较了RIF患者和可育女性容受期子宫内膜，发现差异表达的21种miRNA和14种mRNA，证实了miR-30和miR-200家族成员在容受期子宫内膜组织中特异表达。研究同时发现18种新的miRNA，其中miR-424-5p通过调控细胞黏附因子、Wnt信号传导和细胞周期途径在RIF子宫内膜中显著上调。Liang等[20]从多个方面讨论了miRNA对胚胎植入的调控作用，发现miRNA不仅在细胞内部发挥作用，由于miRNA在生物环境中具有高度稳定性，并可以由子宫内膜和胚胎分泌到细胞外环境，从而促进细胞间信号传导。该研究在人类IVF失败的胚胎培养液中发现较高水平的miR-191，提示miR-191可能作为胚胎植入失败的生物标志物。研究还通过高通量转录组测序比较了子宫内膜上皮细胞与其分泌的外泌体中的miRNA图谱，发现13个miRNA（hsamiR-200c、hsa-miR-17和hsa-miR-106a等） 在外泌体中特异表达，进一步证实这13个外泌体miRNA调控的靶基因参与了多个与胚胎植入相关的信号通路。该研究发现的细胞外miRNA的功能为胚胎植入研究提供了新思路。而且，miRNA可以作为非侵入性生物标志物评估子宫内膜容受性，从而提高辅助生殖技术的妊娠结局。

3.2 lncRNA 其是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在转录沉默、转录激活、染色体修饰、核内运输等方面均具有重要功能。迄今为止，已经通过高通量转录组测序技术鉴定了越来越多的lncRNA。由于一些lncRNA在外周血中保持稳定，并受到内源性RNA酶保护，因此可以作为临床诊断和检测的生物标志物[21]。Sigurgeirsson等[22]应用高通量转录组测序技术对7例可育女性非容受期与容受期子宫内膜行全转录组测序，结果发现516个lncRNA差异表达，其中177个lncRNA在非容受期表达较高，339个lncRNA在容受期表达较高。Chen等[23]通过高通量转录组测序技术对3例RIF患者与3例供精人工授精患者容受期子宫内膜组织的lncRNA表达模式进行全转录组分析，发现742个差异表达的lncRNA和460个差异表达的mRNA。选择与子宫内膜容受性相关的功能评分最高的10个lncRNA和6个mRNA通过qRTPCR进行验证，结果一致。通过生物信息学分析发现这些差异表达的lncRNA通过肿瘤坏死因子（TNF）、TLR、核因子κB（NF-κB）和B细胞受体（BCR）信号传导途径以及破骨细胞分化途径、脂肪酸分解代谢和醚脂质新陈代谢途径调节靶基因聚集，其中TLR和BCR信号传导途径是调节子宫内膜容受性的关键途径。该研究为lncRNA调控子宫内膜容受性的分子机制研究奠定了基础。Xu等[24]通过高通量转录组测序比较5例RIF患者和5例可育女性容受期子宫内膜样本的RNA表达谱，发现1 508个mRNA、169个lncRNA和86个miRNA差异表达；对相关lncRNA进行功能分析，发现TRG-AS1、SIMM25、NEAT1、LNC00511、SLC26A4-AS1和H19的差异表达主要富集于免疫反应、炎症过程、代谢过程及细胞周期途径。并且提出了竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）网络假说，揭示了一种RNA间相互作用的新机制，认为miRNA可以通过结合mRNA导致基因沉默，ceRNA可以通过竞争性结合miRNA调节基因表达，而lncRNA可以调节子宫内膜容受性并参与ceRNA假说。Feng等[25]构建了与RIF相关的lncRNA-mRNA网络（IFLMN），经过拓扑分析、聚类分析及共表达分析筛选出IFLMN中6个关键lncRNA（NONHSAT083203、NONHSAT212577、NONHSAT035952.2、NONHSAT 193031.1、NONHSAT053761.2和NONHSAT025064.2）及其ceRNA子网络，发现其涉及免疫活性、生长因子结合、血管增生、细胞凋亡以及子宫内膜胚胎植入前激素的生物合成过程，提示这6个lncRNA可能成为预测子宫内膜容受性的生物标志物。

4 结语与展望

多个基因数据库信息显示，通过高通量转录组测序结合生物信息学分析，发现25%的RIF患者存在子宫内膜植入窗移位[26]。也有研究表明，高通量转录组测序技术对RIF的阳性预测值达100%[27]。但高通量转录组测序技术指导RIF患者个性化胚胎移植（personal embryo transfer，pET） 的相关报道甚少，部分研究结果尚存在争议，还需要开展大量研究证实。相信随着研究的不断深入，高通量转录组测序技术在子宫内膜容受性以及胚胎植入领域中的作用必将越来越清晰，在人类不孕不育的诊断和治疗中具有广阔的应用前景。