蚊虫共生微生物研究进展

李博琦 刘 铸 李春晓

(1.牡丹江师范学院，黑龙江牡丹江 157000；2.军事医学研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全国家重点实验室, 北京市虫媒病与自然疫源性疾病重点实验室，北京 100071)

双翅目蚊科昆虫，如按蚊属、伊蚊属和库蚊属蚊虫，每年传播的蚊媒传染病导致上亿人感染，对全球公共卫生造成严重威胁。并且由于全球贸易现象导致其以入侵形式影响人类生活，并且范围逐渐扩大(Schaffneretal., 2013, 王晓明等, 2017)。近年来与蚊虫有关共生微生物的研究逐渐成为热点，这些共生微生物包括细菌、真菌和病毒。研究表明，蚊虫共生微生物对于蚊虫的生长、发育、繁殖、进化以及对病原的传播效能都有很大影响。明确共生微生物在蚊虫生命周期和传播循环中的作用，将为蚊虫及蚊媒病防控技术的发展提供新的思路和途径。

1 蚊虫共生微生物研究方法

蚊虫共生微生物的研究方法可以笼统地分为两大类，即细菌培养依赖型方法和非培养依赖型方法(王晓明等, 2017)。培养依赖型方法对培养条件要求较高，同时鉴定的菌种也仅限定在可培养的菌种中，但蚊虫体内的共生微生物通常包含许多不可培养的菌种，所以更适合使用非培养依赖型方法。目前非培养依赖型方法主要使用的分子手段包括变性梯度凝胶电泳(DGGE)、16 S rRNA基因测序、分子杂交、限制性片段长度多态性(RFLP)、核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA)、RT-qPCR等技术以及细菌宏基因组测序技术等(向候君等, 2018)。

宏基因组学是将环境中所有微生物整体作为研究对象，并以测序作为手段，来研究环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系、基因功能及分类等(Levyetal., 2016)。由于其不需要对环境微生物进行培养，是将环境所有微生物进行DNA提取后进行测序，通量高，信息获取也较为全面，因此，在环境微生物和医学微生物等领域得到较为广泛的应用(Daniel, 2005; Baldrianetal, 2011)。高通量技术、宏基因组技术、宏转录组技术是宏基因组学中的关键技术，具有低成本、高准确度等优点，逐渐被应用于蚊虫共生微生物的检测。

蚊虫微生物组分析方法主要有宏基因组、高通量测序和16S rRNA测序(Wangetal., 2009)等，测序后需对测得的微生物进行分类、进化、功能等方面的分析。宏基因组测序发现蚊虫体内主要共生菌为变形菌门(Proteobacteria)，其中包括了Asaia、沃尔巴克氏菌Wolbachia等功能型细菌(Rossietal., 2015)；其中Wolbachia因可引起蚊虫细胞质不亲和，并可降低蚊虫的媒介效能而被应用于蚊虫种群的控制(Caragataetal., 2016)。2017年，研究证实雌性冈比亚按蚊在感染Wolbachia后对恶性疟原虫孢子虫感染率和感染强度明显较低(Gomesetal., 2017)。

2 对蚊虫生理和行为的影响

蚊虫的共生微生物群落数量极其庞大、多样性丰富，对蚊虫的免疫、营养、生理、行为等均有着至关重要的作用。蚊虫体内的微生物也会受到多种因素的干扰，如蚊虫的种类、性别与营养摄入、生长阶段等。

2.1 对蚊虫多样性的影响

按蚊喜好在中大型、较为干净的水塘中孳生，库蚊喜好在中大型、较混浊水体中孳生，而伊蚊则喜好在较小的容器内孳生。按蚊与库蚊喜好在夜间叮咬动物及人类，而伊蚊则主要在白天叮咬。蚊虫由于不同种属的喜好与生活习性不同，导致其体内环境也不尽相同。因此，不同蚊虫所携带的微生物群体的多样性也存在一定的差异。蚊虫体内共生微生物的多样性差异，与蚊虫所处的生理状态和环境不同相关。

利用高通量测序等方法，对不同种蚊虫共生微生物多样性进行检测，发现伊蚊、库蚊、按蚊3个属的主要共生菌种门类均为变形菌门(Minardetal., 2013)。同属蚊虫的微生物组有较高的相似性，但不同属蚊虫之间的微生物多样性就较为丰富了，并且伴随着许多特有的共生细菌(Gimonneauetal., 2014)。例如，在一些研究中提到按蚊的相关微生物组中有假单胞菌属Pseudomonas、产气单胞菌属Aeromonas、Asaia、丛毛单胞菌属Comamonas、伊丽莎白菌属Elizabethkingia、肠杆菌属Enterobacter、多源菌属Pantoea和沙雷菌属Serratia等多种微生物(Gendrinetal., 2013)。环跗库蚊Culextarsalis的主要共生菌为Thorsellia属(Dugumaetal., 2013; Dugumaetal., 2015)；淡色库蚊Cx.pipienspallens的主要共生菌为鞘脂单胞菌属Sphingomonas、Wolbachia属(Muturietal., 2016)；致倦库蚊Cx.pipiensquinquefasciatus的主要共生菌为产气单胞菌属、黄杆菌属Flavobacteria、多源菌属等(Pidiyaretal., 2002; Osei-Pokuetal., 2012)；伊蚊的主要共生菌是Wolbachia和Dysgonomonas属两种微生物(Minardetal., 2014; Minardetal., 2015)。蚊虫体内的核心细菌基因组在不同物种中似乎是相似的，例如Pantoea、Acinetobacter还有Asaia，在蚊虫中非常普遍，可以存在于各个物种间(Crottietal., 2010; Tereniusetal., 2012; Valiente Moroetal., 2013)。

2.2 对蚊虫性别的影响

性别差异使蚊虫体内环境差别较大，行为差也很明显，例如雄蚊不吸食动物或人类的血液，而雌蚊在交配后通常需要吸食血液，从而促进卵巢发育来完成它的生殖周期(Foster, 1995)。雌雄蚊虫的进食差别，导致其从外界获得微生物的谱系和能力方面出现差异，尤其是外源血液中的某些特殊蛋白质等(Wangetal., 2011)。另外，蚊虫的消化道中水解酶差异也导致微生物菌群有了不同的选择(Nation Sr, 2015)。因此，摄入的营养物质的组成和分布也是影响微生物群落的一个重要因素，例如，憩室结构中的高浓度碳水化合物和酸性pH(5.2～6.5)可以对某些微生物组进行筛选(Gusmaoetal., 2007)。除此之外，雌蚊在吸血后会发生发热现象，使免疫活性降低，从而导致微生物含量大量增加(Kumaretal., 2010; Benoitetal., 2011; Oliveiraetal., 2011)。

雄蚊体内检测出了Bacillus和Staphylococcus等微生物群体，而雌蚊体内检测出了Cryseobacterium、Pseudomonas和Serratia等微生物群体(Ranietal., 2009)，推测雌性蚊虫中肠主要由伽玛杆菌组成。另外，假单胞菌属、沙雷氏菌属和肠杆菌属也经常出现在雌性蚊虫的体内(Minardetal., 2013)。雄蚊中肠则主要由硬壁菌门细菌组成，包括葡萄球菌属、芽孢杆菌属、拟杆菌属和微球菌属的细菌(Ranietal., 2009)。类似情况也发生在其他雌性吸血昆虫中肠中。有研究表明，蚊虫体内氧化代谢与免疫功能下调等多方面原因，共同导致了蚊虫吸血前后微生物组的丰富度有所差异(Wangetal., 2011)。

2.3 对媒介传播效能的影响

媒介传播效能是指媒介生物感染和传播病原体的能力(Lambrechtsetal., 2009)，降低媒介传播效能对于防控蚊媒疾病的传播和扩散非常重要。相比于轮胎生活环境，树洞的微生物含量更高，直接导致蚊虫幼虫生活环境差别很大，间接导致媒介效能改变(Yeeetal., 2012)。此外，水体的富营养化有助于促进蚊幼虫更快的发育并提高它们的媒介效能(Buxtonetal., 2020)。这种粪水所致的水体的富营养化大多来源于各种微生物及其产物；这种方式比较容易了解微生物与媒介效能的相关关系，对此还需更深入地研究，以达到大幅度降低媒介效能的目的。

通过研究酵母、细菌和微藻饲料对蚊虫幼虫发育、化蛹时间、成虫大小、羽化率、存活率、寿命和翅膀形态的影响，证明了以细菌和微藻为食的幼虫在发育速度、化蛹时间、成虫羽化和存活率方面均表现出严重的延迟(Souzaetal., 2019)。此外，催化多巴和多巴胺氧化为黑色素的酚氧化酶(POs)及其编码基因AsLac2的表达，对于昆虫的表皮形成和先天免疫维持至关重要，直接影响着蚊虫对外界微生物的感染(Duetal., 2017)。

除了间接影响外，微生物直接影响媒介效能相关的研究也有很多。例如，基因工程改造后，蓝细菌可作为苏云金芽孢杆菌亚种以色列灭蚊毒素的传递载体，在蚊虫生境中降低蚊虫的媒介效能(Ketseoglouetal., 2016)。蚊虫微生物群的优势微生物Asaia与Wolbachia的竞争发育会对蚊虫的性腺生态位产生负面影响(Rossietal., 2015)。此外，立克次体感染可导致节肢动物提高番茄黄叶卷曲病毒的传播效率。LeptolegniachapmaniiSeymour对多种蚊幼虫的致病性导致了幼虫死亡率增高和繁殖力下降，对媒介效能的降低也大有裨益(Pelizzaetal., 2013)。

2.4 在蚊虫不同发育时期的作用

蚊虫卵、幼虫和蛹主要通过孳生的水体来获得大量的共生微生物。蚊幼中肠内发现一种来源于孳生地的蓝藻，这种蓝藻在成蚊体内却没有(Thieryetal., 1991； Vzquez-Martínezetal., 2002)。在冈比亚按蚊幼虫体内，蓝藻在其中肠的含量很高，大概占其全部共生微生物的40%左右(Wangetal., 2011)。针对这点，研究发现许多节肢动物的中肠食物团附近的围食膜(PM)可能对蚊虫摄入微生物有一定影响，而蚊虫的PM围绕着胎粪部分则被称为MPM。在蚊虫蜕变过程中，蚊虫的内部结构发生了根本性的改变，尤其是第一个胎膜周营养基质或膜(MPM1)在蛹的早期形成，第2个(MPM2)在成虫羽化时出现，MPM隔离了在幼虫阶段摄入的微生物使成虫的肠道内微生物得到清除，这些微生物残渣在成年后会排泄出去(Molletal., 2001；Moncayoetal., 2005)。这种现象很好地解释了幼虫与成蚊的微生物群落差异为什么会那么大，例如冈比亚按蚊的幼虫和蛹时期的微生物数量是其成蚊的3倍(Wangetal., 2011)。这种变化产生的原因可能是由于围食膜在蚊虫不同阶段的状态不同(Moncayoetal., 2005)。

总体来说，环境对蚊虫共生微生物的影响是很大的，野生株蚊虫的微生物丰度一般都要高于实验室蚊虫的丰度，这与环境中微生物的种类、数量有着一定的关系(Nation Sr, 2015)。另外，蚊虫体内的共生微生物不仅来自于孳生的环境，也可来源于母代，例如在致倦库蚊、淡色库蚊和白纹伊蚊中，沃尔巴克氏菌属的一些种类就可以通过卵巢垂直传播从母代传递至子代，Asaia在冈比亚按蚊Anophelesgambiae和斯氏按蚊An.stephensi中也是如此( Kittayapongetal., 2002；Cooketal., 2010；Damianietal., 2010)。

3 在蚊虫防控中的应用

现今防控蚊虫最常用的方法是使用化学杀虫剂，但杀虫剂具有环境污染、不可持续及易造成抗性蚊虫产生等多方面缺点，不宜作为长期的防控措施(Davidetal., 2010)。基于蚊虫共生微生物的生物防治措施具有环境友好、对人类安全无害等优点，在蚊媒和蚊媒病的防控方面具有良好的应用前景(Ahmedetal., 2017)。目前，蚊虫共生微生物中应用于蚊媒病防控主要是Wolbachia，而随着分子生物学和基因工程技术的发展，以及对蚊虫肠道微生物的日益了解，更多的微生物靶标会被发现，将为蚊媒传染病的控制提供新的思路和途径。

3.1 Wolbachia在蚊虫防治中的应用

Wolbachia是立克次体科(Rickettsiaceae)沃尔巴克氏体属Wolbachia的一类微生物(Hilgenboeckeretal., 2008)。1971 年，首次提出胞质不相容性现象与Wolbachia相关联的假设(Yenetal., 1971)。Wolbachia可诱导配子结合时的胞质不相容性(cytoplasmic incompatibility，CI)，即当感染了Wolbachia的雄性与不感染或感染了不同型别Wolbachia的雌性交配，雌性产的卵不能成功孵化。除了诱导胞质不相容性机制外，Wolbachia还会使其宿主产生杀雄行为、雌性化以及孤雌生殖(Gloria-Soriaetal., 2018)。同时，会降低宿主的生殖能力、缩短宿生成虫期的寿命和降低宿主的活动能力等(Suroowanetal., 2016; Caputoetal., 2019)，这些生殖方式能够使Wolbachia在宿主种群中广泛传播。目前大量研究显示，通过转染不同Wolbachia可以达到控制蚊媒和蚊媒病的目的(Moreiraetal., 2009; Walkeretal., 2011; Naznietal., 2019; Rossetal., 2020; Huetal., 2020)。

除胞质不相容性之外，Wolbachia还会影响蚊虫对病原体的感染和传播能力。已经证实在白纹伊蚊、埃及伊蚊和波利尼西亚伊蚊Ae.polynesiensis等蚊虫对一些病毒有拮抗作用(Moreiraetal., 2009; Bianetal., 2013; Bonneauetal., 2019)。例如埃及伊蚊体内的Wolbachia可以防止蚊虫感染登革病毒和其他黄病毒(Moreiraetal., 2009; Walkeretal., 2011)。将Wolbachia引入蚊虫体内来阻止登革病毒传播到主要媒介蚊虫的种群中，通过在马来西亚大吉隆坡的6个不同地点进行测试，发现在温度较高的条件下，释放地点人群中的登革热发病率会降低(Naznietal., 2019)。近年来，人们发现Wolbachia对蚊媒病毒的感染传播有影响后，进行了很多相关的研究。研究发现，感染WolbachiawMel菌株的埃及伊蚊会因为高温而降低wMel的感染率，实验证明感染率在高温影响后的第1个月有较严重影响，会将感染率降低到88%和83%，但在4个月后又恢复到了几乎100%。这说明高温对wMel的感染率的影响是暂时的，过段时间就会恢复到原状(Rossetal., 2020)。

除了功能性研究外，还有学者对Wolbachia感染蚊虫的地理因素也进行了研究，例如对中国地区和其他国家地区的Wolbachia感染率进行了调查，认为中国Wolbachia感染的自然流行率远低于其他国家或地区。并且在此基础上，对Wolbachia的gatB、coxA、hcpA、ftsZ、fbpA和wsp基因进行测序，确定了wAlbB的新序列类型(ST)，并进行了验证，证明了wAlbB与其他族系有着一定的差别，证实了其是一只单独的族系(Huetal., 2020)。该项研究不仅证明了Wolbachia对白蚊伊蚊的感染率与地区有着一定联系，还证明了可以感染蚊虫的Wolbachia中又多了一个品系，对于Wolbachia的研究又进了一步，也给我们更多关于解决蚊媒传染病防控问题的思路。除此之外对蚊虫感染Wolbachia的感染率与传播率及受感染导致的不受精率进行相关性分析，通过现场调查结合建立数学模型等手段对实验数据进行分析发现，蚊虫对Wolbachia的初始感染率能直接影响传播率，感染率越高，传播率与胞质不相容率也会相对越高，并且经过传播最终会导致所有的野生株样本都感染(Alfanoetal., 2019)。这种数学模型的意义不仅仅是在说明上述问题，更大的意义是为感染率相关研究提供了一种研究手段和研究思路，也会促进后续对于Wolbachia感染蚊虫的相关研究。这种研究方法在多年前就开始进行了，建立了具有常数出生率和依赖密度的死亡率的数学模型(Keelingetal., 2003；Farkasetal., 2010)，用延迟微分方程研究了Wolbachia感染动力学(Zhengetal., 2014)，讨论了将Wolbachia引入蚊虫种群对人类登革热病例的影响(Ndiietal., 2015)。近年来，研究者开始尝试将基于Wolbachia感染的昆虫不相容技术(incompatible insect technique，IIT)与昆虫不育技术(sterile insect technique，SIT)相融合，应用于蚊虫控制与蚊媒病防控。该技术主要通过释放携带有不同种Wolbachia的野生雄蚊，通过胞质不相容诱发雌蚊不育。近几年，IIT与SIT联合应用获得了突破性进展(Zhengetal., 2019)。2016 年，澳大利亚首次报道了通过小规模现场试验释放人工转染Wolbachia的蚊虫进行种群抑制的实验结果(O′Neill, 2016)。2019 年，提出应用IIT与SIT结合的技术来消灭白纹伊蚊(Zhengetal., 2019)。通过胚胎显微注射技术，将库蚊体内的WalbachiawPip转移到白纹伊蚊HC蚊株体内，同时，对HC雌蚊进行低剂量辐射后，按2%比例将其释放混入野生种群中。通过2～3年持续释放数百万工厂化饲养处理后雄性蚊虫，在2个试验点基本清除或接近清除了白纹伊蚊的种群数量，2年内野生成蚊数量平均减少了83%～94%，持续6周内没有检测到成蚊。野生幼虫数量年度平均减少超过94%，持续13周没有检测到活蚊卵。然而由于社会伦理和生物安全等问题，Wolbachia离实际大规模应用还有一定距离，随着对其胞质不相容机制和对病原体感染传播抑制机制的进一步阐明，基于Wolbachia的生物防治技术在蚊媒与蚊媒病防控领域将具有广阔的应用前景。

3.2 未来可能应用于蚊虫防控的微生物新靶标

随着宏基因组和肠道微生物组研究技术的逐渐普及，除Wolbachia之外，研究者开始针对蚊虫其他共生微生物开展研究，以期发现更安全、更有效且更适用于野外现场蚊虫防控的微生物新靶标。

Ahmed等分离出2种共生菌(HRM1和HS1)，测试这2种菌对于尖音库蚊的杀灭功能，结果显示，经过HS1处理过的幼虫中肠有明显变形，证明了这2种菌具有防治蚊幼的应用前景(Ahmedetal., 2017)。此外，在疟疾相关媒介蚊虫卵巢中发现一种沙雷氏菌菌株(AS1)，AS1可以稳定地存活在蚊虫中肠、雌性卵巢和雄性附属腺中，并可在整个蚊虫种群中迅速传播。利用AS1达到对蚊虫种群控制的相关研究也在进行之中(Wangetal., 2017)。另外一种沙雷氏菌——粘质苏云金杆菌(Wuetal., 2019)，该菌分泌的SmEnhancin可以消化蚊虫肠道上皮细胞上的膜结合粘蛋白，从而促进病毒传播。体内含有这种菌的伊蚊相较于不含这种菌的野生伊蚊更容易感染病毒，smEnhancin蛋白还能调节哺乳动物宿主肠道病原体的感染(Wuetal., 2019)。

反方向控制传播效能的研究表明，冈比亚按蚊吸食了含有抗生素的血液后会扰乱体内的微生物种群，使得冈比亚按蚊对疟疾的易感性增加，还会增强蚊虫的存活率以及繁殖率，进而提高媒介效能(Gendrinetal., 2015)。通过对抗生素类药物的控制使用来间接地降低蚊虫对疟疾的传播效能。另外，也可以通过驱避和引诱的方式来进行虫媒病防治的研究。人类皮肤细菌及其分泌物对冈比亚按蚊、白纹伊蚊和埃及伊蚊等的作用，比现有的引诱剂与驱避剂更有优势，但具体应用还需要进一步的研究(Michaletetal., 2019)。

同时，Elizabethkingia、Chryseobacterium和Wolbachia属以及细菌纲的未分类微生物也有可能成为一种新的蚊虫控制方法，应用于虫媒病的防控(Guéganetal., 2018)。