内质网应激在牙周炎影响全身疾病过程中的作用

李鑫 李艳 丁旭 夏博园 于维先

吉林大学口腔医院牙周病科 吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室 长春130021

牙周炎是发生在牙周组织的慢性感染性疾病，是全球最流行的慢性炎性疾病之一，表现为牙龈软组织和牙槽骨等牙周组织的持续破坏，最终导致牙齿缺失[1]。其发病机制与多种危险因素有关，其中最重要的是牙菌斑中的复杂生物群体和宿主的防御功能。在牙周炎发展进程中，细胞因子同样发挥重要作用[2]。众多研究表明，牙周炎可增加全身疾病（阿尔兹海默症、心血管疾病、糖尿病、高血压、慢性肾病等）的发生风险[3‑7]。

近年来牙周炎组织细胞中细胞器的病理变化受到了学术界的广泛关注。内质网是内膜构成的封闭的网状管道系统，是细胞中的重要细胞器，是蛋白质折叠加工、脂类合成及转运的重要场所。炎症、氧化应激、缺氧等均可引起内质网的功能障碍[8‑10]，进而导致蛋白质折叠异常，通过激活内质网跨膜蛋白肌醇需求酶1（inositol‑requiring en‑zyme 1，IRE1）、蛋白激酶样内质网激酶（protein kinase‑like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和激活转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）介导的信号通路引起未折叠蛋白反应（un‑folded protein response，UPR），从而缓解内质网压力，维持细胞稳态。当刺激持续存在时，超过细胞自我调节能力，内质网应激可通过C/EBP 同源蛋 白（C/EBP‑homologous protein，CHOP） 途径导致细胞凋亡。另外，通过内质网应激也可以激活白细胞介素（interleukin，IL）‑8、IL‑4 和肿瘤坏死因子‑α（tumor necrosis factor‑α，TNF‑α）等炎症因子来介导炎症的发生[11]。

已有许多临床证据显示，在牙周炎病变中，炎症因子可通过引起未折叠蛋白质的积聚引起内质网应激[12]，从而进一步破坏牙周组织。同时，内质网应激通过介导细胞凋亡，参与了全身慢性疾病的发生发展[13]。本文介绍了内质网应激在牙周炎影响全身性疾病中的作用研究，旨在进一步说明牙周炎对全身疾病影响的机制，为与牙周炎相关的全身疾病的防治提供新的思路。

1 内质网应激

内质网应激是外部刺激使细胞内质网生理功能发生紊乱的亚细胞器病理状态，表现为内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白质的积累。内质网将正确折叠的蛋白质转运至高尔基体，而折叠异常的蛋白质被保留在内质网腔内，通过内质网相关降解作用被逆转运至细胞质并降解。当未折叠蛋白的积聚超过内质网降解能力时，形成蛋白质聚集体，并激活UPR，缓解内质网应激状态，维持细胞内稳态；而持续的内质网应激则会触发IRE1‑TRAF2‑ASK1 途径和CHOP 介导的凋亡信号诱导细胞凋亡[14]。不利的局部环境，例如：炎症、缺氧、Ca2+稳态破坏等，均可引起未折叠蛋白的聚集，导致内质网应激[15]。UPR 包括3 条主要途径，由内质网膜上3 个蛋白质传感器激活[16‑17]：IRE1、PERK和ATF6。

1.1 IRE1途径

IRE1 是内质网压力传感器，通过感测内质网腔内压力变化触发UPR。错误折叠蛋白积累时，IRE1 核糖核酸酶通过构象变化，自磷酸化和寡聚化被激活，继而与调节UPR 相关基因的转录因子X‑box结合蛋白1（X‑box binding protein 1，XBP1）结合，介导信号传导，通过降解或重折叠内质网腔中累积的错误折叠蛋白而缓解压力。在不可逆内质网压力下，IRE1α 可介导凋亡启动子caspase‑2的活化，从而触发细胞凋亡。此外，内质网应激延长时，激活的IRE1 与肿瘤坏死因子受体相关因子2 （TNF receptor‑associated factor 2，TRAF2）以及细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal‑regulating kinase 1，ASK1） 结 合，形 成IRE1/TRAF2/ASK1 复 合物，诱 导c‑Jun 氨 基 末端激 酶（c‑Jun N‑terminal kinase，JNK）磷酸化，进而导致细胞凋亡[18]。

1.2 PERK途径

PERK 也称为真核翻译起始因子2‑α 激酶3，是一种蛋白激酶。内质网应激期间内质网分子伴侣BiP与PERK 分离，使其自身磷酸化，继而使真核翻译起始因子2α（eukaryotic translation initia‑tion factory 2α，eIF2α）磷酸化，并选择性诱导ATF4，从而选择性诱导UPR 靶基因表达。当细胞内发生不可逆内质网应激时，ATF4 通过增强CHOP的表达，下调抗凋亡线粒体保护蛋白，即B淋巴细胞瘤‑2（B‑cell lymphoma‑2，BCL‑2），上调仅含BH3结构的蛋白质，DNA损伤诱导蛋白34（growth arrest and DNA damage34，GADD34）的表达，促进细胞凋亡[19]。

1.3 ATF6途径

ATF6 是1 种隐性转录因子，在内质网应激时与Bip的结合被破坏，转运至高尔基体，被高尔基体的2 个位点蛋白酶（S1P 和S2P）裂解，随后转运至细胞核，与内质网应激反应原件（endoplas‑mic reticulum stress response element，ERSE）结合，诱导编码内质网伴侣，促进UPR靶基因表达[20]。

2 内质网应激与牙周炎的关系

细胞凋亡参与了牙周炎的病理生理过程，而内质网应激通过CHOP，即GADD153 下调Bcl‑2的表达，使细胞对凋亡敏感，从而诱导细胞凋亡[21]。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）[22]中检测到PERK、ATF4、CHOP 等内质网相关蛋白的表达，证实了LPS可以诱导PDLSCs发生内质网应激。尼古丁的刺激使牙周膜细胞中内质网应激经典标志物GRP78 上调，调节细胞死亡的其他内质网应激基因（如PERK 和eIF2α）磷酸化，CHOP 上调，诱导牙周组织细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解，加剧细胞坏死和牙周结缔组织破坏[23]。在牙龈卟啉单胞菌LPS[24]处理后的人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs） 中C/EBPβ 基 因 表 达 增加，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）表达，促炎细胞因子IL‑6 和IL‑8 表达上调，PERK 和eIF2α 的磷酸化均显着上调，GRP78/Bip 和CHOP 的表达增加。这些结果表明，牙龈卟啉单胞菌LPS诱导的内质网应激调节hPDLCs炎症反应和ECM 的降解。在内质网应激时，PERK‑eIF2α‑ATF4 途径被激活，并通过靶向晚期分化中特定成骨细胞标志物影响成骨细胞的存活、增殖和终末分化，从而影响成骨功能[25]。在牙龈卟啉单胞菌诱发的小鼠实验性牙周炎中[26]，内质网应激通过介导单核细胞趋化蛋白‑1（monocyte che‑moattractant protein‑1，MCP‑1）诱导单核细胞分化为破骨细胞（osteoclast，OC）前体细胞，与假手术组相比，牙龈卟啉单胞菌组IL‑6，TNF‑α，OCs 标记基因和组织蛋白酶K （cathepsin K，CTSK）表达上调，参与牙槽骨的吸收。而内质网应激抑制剂4‑PBA则明显抑制了OC的功能，减少了牙槽骨的吸收。进一步研究表明，4‑PBA 抑制了内质网应激诱导的牙龈成纤维细胞死亡和自噬[27]。Xue 等[28]通过体内和体外实验均证明了牙周炎可以通过内质网应激调节PDLSCs 的成骨能力：IL‑1β 和TNF‑α 作用于H‑PDLSCs 后，UPR 靶基因表达上调，成骨标记蛋白和骨钙素基因表达及矿化结节形成减少，4‑PBA 处理后则结果相反；在SD 大鼠牙周炎模型中，衣霉素（tunicamycin，Tm）组比其他组发生的牙槽骨吸收更多，但Tm联合PERK 抑制剂给药后牙槽骨吸收明显减少。这些研究结果证明牙周炎可以引起内质网应激，内质网应激能进一步促进细胞坏死和牙周组织的破坏，参与牙周炎的发展。

3 内质网应激在牙周炎相关的全身性疾病中的作用机制

牙周炎作为一个潜在的危险因素，可能导致肝脏损伤[29]、糖尿病[30]、动脉粥样硬化[31]等全身性疾病发病的风险[32]，炎症反应、炎症因子的刺激可能是两种疾病的中介，但具体机制尚不清楚。然而近年来一系列研究表明内质网应激同样与牙周炎相关的全身系统疾病关联密切。内质网应激参与了牙周炎对全身系统疾病的作用，但是全身性疾病是否会通过内质网应激影响牙周炎的发展目前尚无结论。

3.1 内质网应激与肝损伤

众所周知，肝细胞坏死是肝脏疾病的重要因素。在肝损伤过程中，外源性刺激可以诱导内质网应激，引起肝细胞凋亡，进而导致肝损伤。体外研究[33]发现，山奈酚可调节Grp78和CHOP的表达从而影响内质网应激诱导肝细胞凋亡。在牙周炎大鼠模型中[34]可以观察到中央静脉周围出现明显的脂肪变性，坏死的肝细胞，单核细胞通过油红O 染色检测到脂质滴，并且牙周炎组肝细胞脂肪变性的大鼠血清LPS 水平高于同组没有脂肪变性的大鼠。牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要致病菌，其产生的LPS 可诱导大鼠非酒精性脂肪性肝炎的发生[35]。Shi 等[36]通过腹腔注射LPS 建立肝损伤模型，并在其中检测到内质网应激标记物CHOP 表达明显升高，从而证明持续的内质网应激可以诱导肝细胞死亡，最终导致肝损伤。体内及体外研究[37]均证实，皮卡替诺醇可通过下调CHOP 的表达，减轻内质网应激介导的炎症，从而缓解LPS 诱导的肝损伤。一系列实验结果揭示了内质网应激在肝损伤过程中的作用。

3.2 内质网应激与糖尿病

一直以来，内质网应激被认为是2 型糖尿病的发展因素。胰岛素是胰腺β 细胞产生的激素，以维持葡萄糖稳定，β细胞分泌胰岛素不足可促进糖尿病的发生发展[38]。2007 年，Laybutt 等[39]用棕榈酸酯处理热激蛋白5 表达载体转染的MIN6 细胞，发现真核翻译起始因子激酶2‑α 激酶3 及其真核翻译起始因子2A 磷酸化降低以及活性XBP1，DNA 损伤诱导转录本3 和caspase‑3 产生减少，并且在2型糖尿病动物模型和人类2型糖尿病受试者胰岛中检测到内质网应激相关基因的激活，证明内质网应激是β 细胞脂质凋亡的必要条件，有助于2型糖尿病的发展。在牙周炎复合2型糖尿病组大鼠中观察到胰岛结构紊乱，胰岛β 细胞数量减少。研究证实了LPS可诱导Bip/GRP78，XBP‑1和CHOP 转录物的表达，而抑制ATF4，CHOP 的表达可促进胰腺β 细胞的存活[40‑41]。Domon 等[42]在牙周炎患者的牙龈活检组织中检测到内质网应激时与IRE1 结合的转录因子XBP1 表达上调，而腺病毒介导的Xbp1s过表达诱导β细胞凋亡，并且减少胰岛素的分泌[43]。IRE1α 激酶可触发细胞凋亡[44]，进一步导致剩余的β细胞变性，最终导致2型糖尿病。此外，研究证实脂肪组织是胰岛素抵抗发生的起始部位和重要的场所。有学者体外培养3T3‑L1 前脂肪细胞，并诱导其分化为脂肪细胞，用牙龈卟啉单胞菌LPS 作用于脂肪细胞来模拟牙周炎对脂肪组织的致炎过程，检测到GRP78、XBP1s表达升高。从而验证了内质网应激参与了牙周炎介导的脂肪组织炎症，进而加重胰岛素抵抗，揭示了牙周炎与2型糖尿病发生发展的关系。

3.3 内质网应激与心血管疾病

内质网应激还会影响心血管的功能。Liu 等[45]认为内质网应激通过增加GRP78，CHOP 的表达，可以促进内皮细胞凋亡的速率。而Pedruzzi等[46]通过体外实验证实，内质网应激中IRE1、JNK 等的表达可以促进NADPH 氧化酶4 的表达从而引起平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）死亡，而IRE1 的沉默可抑制该酶表达，减少了SMC 的死亡。实验证实内质网应激参与了心脏和血管的病理生理过程，许多调节内质网应激的药物可以用于治疗心血管疾病。在大鼠肠系膜微动脉损伤模型中Chen 等[47]在LPS 刺激的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）中观察到内质网应激标志物（GRP78/Bip和CHOP）的水平显著增加。Hirasawa 等[48]在牙龈卟啉单胞菌感染的HUVEC 中检测到GADD153，GRP78 和caspase‑12 的表达上调，而添加内质网应激抑制剂或抗caspase‑12试剂后牙龈卟啉单胞菌诱导的HU‑VEC 细胞凋亡明显降低，初步表明牙龈卟啉单胞菌可引起内质网应激，介导细胞凋亡，增强自噬，从而促进血管的粥样硬化，引起心血管疾病。为了研究牙周炎是否通过调控内质网应激介导的凋亡影响血管钙化，有学者建立大鼠动物模型，分为正常对照组、牙周炎组、血管钙化组及牙周炎‑血管钙化联合组，结果显示联合组中心血管管壁弹性纤维结构不清，Caspase‑3、GRP78、GRP94和CHOP 在联合组中的表达明显高于正常组。这些结果提示，内质网应激可能是通过CHOP 途径参与了牙周炎对心血管钙化的影响。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。