药物调控牙髓干细胞成骨分化的研究进展

郭雨婷 吕学超

哈尔滨医科大学口腔医学院 哈尔滨医科大学附属第一医院儿童口腔科 哈尔滨150000

颌面部外伤、先天性畸形、炎症、肿瘤等均可造成颌面部骨骼和牙槽骨的缺损，这不仅会使患者面部畸形，而且还会影响机体的语言、呼吸等功能，在生理和心理上都会给患者带来不良影响。目前，临床上骨缺损修复的主要方法是骨移植，但骨移植技术存在缺陷，包括骨缺损修复不良、术后疼痛、供体部位具有感染风险、免疫排斥反应等，因此，其在临床中的应用受到了限制[1-2]。牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是牙髓组织内未分化外胚间充质干细胞，其来源广泛、免疫原性低、无伦理争议，具有较强的自我更新能力和多向分化潜能。因此，基于以上特性和相关临床研究，DPSC作为种子细胞可以很好地应用于骨缺损修复及牙体组织工程领域。

研究发现DPSC的成骨分化受多种因素影响，本文就药物对其调控进行重点论述，并对DPSC成骨分化的应用进行展望。

1 DPSC

1.1 DPSC的研究现状

DPSC是由Gronthos等[3]于2000年从人第三磨牙牙髓中提取并分离的一类成体干细胞，具有较强的增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能。在不同因素的调控下，DPSC可分化为各类功能性细胞，如成牙本质细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成血管细胞、成脂肪细胞、神经样细胞等[4-5]。DPSC在组织修复和器官重建中具有很好的应用前景，目前，广泛应用于骨、牙、神经、血管、软骨等领域的再生研究[6-8]。作为种子细胞，DPSC在成骨方向上具有一定的优势，可用于下颌骨的修复，能够促进种植体与周围骨的结合[9-10]。DPSC因其高度自我更新、低免疫原性、多向分化能力及不违背伦理道德的优势常作为种子细胞，用于组织工程和生物医学的相关领域，并受到越来越多研究者的广泛关注。

1.2 DPSC的生物学特征

DPSC大多数呈梭形，类似于牙髓成纤维细胞，其表达的间充质细胞及干细胞表面标志物有STRO-1、CD29、CD44、CD73、CD90、波形蛋白及核干细胞因子等[2]。作为一种有前景的种子细胞，DPSC相较于其他干细胞，有很多优势：1）DPSC可以在拔牙或乳牙自然脱落时轻易获取，分离方法简单、成本低且对人体损伤小甚至无影响，其来源包括拔除的第三磨牙、多生牙以及正畸减数的牙[11]；2）研究[12-13]发现，DPSC的自我更新及增殖能力较骨髓、牙周膜等来源的间充质干细胞更强；3）DPSC拥有优良的分化潜力，研究[14-15]发现，DPSC比骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）、子宫内膜干细胞（endometrial stem cell，EnSC）等具有更强的成骨向分化能力。

1.2.1 高度增殖及自我更新特性 Gronthos等[3]的研究表明：DPSC的增殖率及克隆形成率显著高于BMSC，且DPSC在传代以后依然可以保持较高的增殖能力。之后，Gronthos等[3]从人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSC）与羟磷灰石/磷酸三钙（hydroxyapatite/tricalcium phosphate，HA/TCP）复合移植物所形成的牙本质-牙髓样结构中，再次分离其中的基质样细胞，并将其扩增后重新移植到免疫缺陷的小鼠皮下，结果依然能够形成一种类似牙本质-牙髓样组织，对形成的牙本质-牙髓样组织进行免疫组织化学检测，发现其牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）表达阳性。上述研究证明DPSC具有较高的增殖及自我更新能力。

1.2.2 免疫学特性 DPSC作为成体间充质干细胞家族中的一员，其免疫特性与BMSC相仿。Ding等[16]的体外研究发现：DPSC不能引起同种异体T细胞的增殖反应，且与DPSC的混合淋巴细胞反应中，T细胞和B细胞增殖均受到了不同程度的抑制；该研究还显示：DPSC具有低免疫原性与负免疫调节功能。Hossein-Khannazer等[17]对未分化的DPSC和成骨分化后的DPSC（osteogenic differentiated DPSC，OD-DPSC）进行了免疫性研究，验证OD-DPSC是否具有免疫调节功能。实验中，将DPSC和OD-DPSC与同种异体的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以不同比例共培养，测定共培养后PBMC的增殖情况，检测转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、一氧化氮（nitric oxide，NO）浓度的水平，以及吲哚胺2，3-双加氧酶（indole amine 2，3-dioxygenase，IDO）、人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen G，HLA-G）和肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）基因的表达情况。结果显示：DPSC和OD-DPSC均能抑制PBMC的增殖，且抑制程度无明显差别。在OD-DPSC与PBMC的共培养体系中，PGE2、IL-6、TGF-β的水平以及NO的产量大幅增加。此外，IDO、HLA-G和HGF基因的表达没有发生改变。以上结果表明：DPSC的成骨分化未影响其免疫调节活性，OD-DPSC仍保持DPSC原有的免疫调节功能，这对DPSC的异体移植治疗骨缺损具有重要的临床意义。

1.2.3 多向分化潜能特性 DPSC具有多向分化潜能的特性，是多能性间充质干细胞的重要来源。Awais等[18]的研究表明：DPSC具有较强的成骨分化能力，可应用于口腔颌面外科再生医学等领域。Huang等[19]的研究表明：二价金属磷酸盐与壳聚糖支架复合能持续诱导DPSC的成骨分化。Suchanek等[20]的研究证实了来源于新生牙的DPSC具有分化为胰岛素产生细胞（insulin-producing cell，IPC）的潜能，这一发现对于Ⅰ型糖尿病的治疗具有重要意义。Zou等[21]对hDPSC向血管内皮细胞的分化进行了研究，实验过程中用轴突导向因子4D（semaphorin 4D，sema4D）作用于hDPSC，研究结果显示：血管内皮相关基因和蛋白显著上调，说明sema4D/受体丛状蛋白B1（plexin-B1）信号通路能够促进hDPSC向成血管细胞分化。此外，DPSC除了向成骨、成胰岛素、成血管等方向分化外，还可向神经元细胞方向分化，这一特性在神经遗传病的治疗研究中具有很好的应用前景[22]。总而言之，在不同的诱导条件下，DPSC可分化为成骨细胞、成牙本质细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素产生细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。DPSC的多向分化能力在组织工程领域具有极大的应用前景[23-24]。然而，要实现DPSC的临床应用，对其分化调控的研究就显得尤为重要。

2 调控DPSC成骨分化的药物

研究表明：DPSC在组织工程领域具有广阔的应用前景，然而为了更好地应用于临床，就需对DPSC进行诱导或调控，使其定向分化，从而达到临床使用的要求。近年来，随着研究的深入，众多研究者不断尝试用新的方式调控DPSC成骨分化，如物理方法诱导、药物调控和支架共培养等。相比于其他方法，药物在调控DPSC成骨分化方面具有以下优势：1）药物经过了系统的药理性、毒理性研究以及长期的临床检验，具有普遍适用性；2）药物可经大批量生产，价格相对低廉，且稳定性好；3）体内外应用方式灵活，可与DPSC联合应用于骨缺损治疗，具有临床转化的意义。因此，下面论述相关药物对促进DPSC成骨分化的作用。

2.1 天然药物

天然药物是在现代医药学理论指导下使用的天然药用物质及制剂，其来源包括植物、动物和矿物，是非人工合成制备的药物。其中，中药及其提取物被视为天然药物的重要组成部分，有极高的研究价值。

骨碎补是骨伤科常用的中药，能增强成骨细胞活性、提高骨密度、维持骨微结构的完整程度，对hDPSC和人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cell，hPDLSC）有促进增殖和成骨分化的作用[25-26]。骨碎补的主要有效成分为柚皮苷和总黄酮，前者对脂质代谢有一定改善作用，后者能明显抑制骨密度下降，可在抑制破骨细胞活性的同时促进成骨细胞增殖，提高成骨细胞内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，从而促进骨形成[27-28]。研究[29]发现：将骨碎补提取液作用于人牙髓细胞（human dental pulp cell，hDPC），能增强ALP活性，增加纤维粘连蛋白的合成和分泌，对hDPC表现出了明显的体外诱导作用。Huang等[30]的研究初步证实了一定浓度的骨碎补总黄酮能促进DPSC的增殖，提高ALP的活性和促进钙结节形成，也可促进DPSC的成骨分化，其机制可能与磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路有关。此外，骨碎补柚皮苷也可提高hBMSC、hPDLSC等细胞的成骨分化潜能[31]。

黄芩苷是传统中药黄芩中的主要成分，属于黄酮类，具有多种生物学功能，包括保护组织细胞、抑菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等作用[32]。黄芩苷可促进成骨细胞ALP的活性，同时可以通过激活β-catenin/wnt通路从而促进成骨分化。薛晶等[33]的研究表明：黄芩苷对hDPSC的增殖无明显影响，适宜浓度的黄芩苷可促进hDPSC的ALP活性及成牙/成骨分化。

黄连素又称小檗碱，是从蓼科药用植物中提取的活性生物碱，具有抗菌、抗炎、消热解毒、抗氧化、促进干细胞成骨分化等作用，广泛的应用于牙周炎的治疗和牙髓再生领域[34-35]。Xin等[36]研究了黄连素对DPSC成骨分化的影响，结果表明：一定浓度的黄连素可通过激活表皮生长因子受体/促分裂原活化蛋白激酶/runt相关转录因子2（epidermal growth factor receptor/mitogen-activated protein kinase/runt-related transcription factor 2，EGFR-MAPK-Runx2）通路促进DPSC的成骨分化。

淫羊藿苷是治疗骨质疏松症中草药淫羊藿中的一种主要黄酮类化合物。现代药理学研究[37]表明，淫羊霍苷具有抗骨质疏松、促进干细胞骨向分化、免疫调节等生物学功能。麻丹丹等[38]的实验研究证实：当淫羊藿苷的浓度为10-5mol·L-1时，其可上调hDPSC中ALP、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）和牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）矿化相关基因的表达，说明一定浓度的淫羊藿苷可明显促进hDPSC的成骨向分化。

二氢杨梅素又称蛇葡萄素、双氢杨梅素、藤茶等，属于黄酮类化合物，研究[39-40]证实：二氢杨梅素具有抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物、降血糖、调血脂及促进干细胞成骨分化等作用。李夏宁[41]的研究发现：一定浓度的二氢杨梅素对人乳牙牙髓干细胞无细胞毒性，且可促进其成骨向分化。调控机制可能与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）家族中的BMP-4通路以及βcatenin/wnt信号通路有关[42]。

2.2 化学合成药物

化学合成药物是指以化学理论为指导，依据化学规律研究和生产的药物。随着化学及药学的不断发展，化学合成药物得到了快速的发展，其特点是对疾病治疗疗效快、效果明显，在各类疾病的治疗中有广泛的应用。

2.2.1 降脂药物 他汀类药物（statins）是临床常用的降脂药物之一，是竞争性3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的特异性抑制剂，能够降低胆固醇、降低血脂，促进骨形成，可有效治疗骨质疏松症等[43-44]。他汀类药物主要包括辛伐他汀（Simvastatin，SIM）、洛伐他汀（Lovastatin，LOV）、阿托伐他汀（Atorvastatin，ATV）等。其中，SIM是以LOV为原料，经化学合成得到的他汀类药物。

Zijah等[45]评价和比较了氟化钠（NaF）、黑色素细胞刺激素（melanocyte-stimulating hormone，MSH）和SIM这3种添加物对聚己酸内酯-聚乙二醇-聚己酸内酯（poly-caprolactone-poly-ethylene glycol-poly-caprolactone，PCL-PEG-PCL）纳米纤维支架材料在hDPSC成骨/成牙中的作用，实验研究了hDPSC的活性、黏附力、成骨/成牙相关特异性基因的表达，结果表明：MSH和SIM处理的hDPSC黏附行为增强、钙沉积增加及成骨/成牙本质特异性基因表达均显著增高，说明SIM具有促进hDPSC成骨/成牙的作用。Samiei等[46]研究了SIM对hDPSC在3D纳米纤维聚乙酸内酯/聚乳酸/羟磷灰石（poly-caprolactone/poly lactic acide/hydroxyapatite，PCL/PLLA/HA）聚合物支架上成骨分化的影响，比较在添加SIM之前和之后2周的BMP-2、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、Runx2和DSPP相关骨形成基因的表达情况，扫描电子显微镜成像结果显示：经SIM处理的PCL/PLLA/HA纳米纤维支架，其上的hDPSC黏附力有所改善；茜素红染色结果显示：该组中矿化组织显著提高；定时定量逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）实验证实：PLLA-PCL-HA(0.1)-SIM组中的骨/牙生成标志物BMP-2、OCN、Runx2和DSPP基因表达均上调。以上结论表明SIM可促进hDPSC的成骨分化。

2.2.2 抗炎药物 抗炎药物是治疗组织受到损伤后所发生的反应炎症的药物，包括2类：一类是非甾体抗炎药，如阿司匹林（Aspirin）等；另一类是甾体类抗炎药物，指类固醇类物质，如糖皮质激素（glucocorticoids，GC）等。

阿司匹林是一种独特的化学合成药物，在水杨酸的基础上用乙酰基取代羟基，因此也被称为乙酰水杨酸（acetylsalicylic acid，ASA），是使用最广泛的解热、镇痛、非甾体抗炎药。定期服用ASA对患者的骨密度具有有益的影响，ASA具有促进骨骼再生的潜力，在再生医学领域有很好的应用前景[47-48]。Yuan等[49]的研究结果显示：ASA上调hDPSC成骨标志物胶原Ⅰ型蛋白（collagen typeⅠ，Col-Ⅰ）、ALP、Runx2和OCN的表达水平，表明ASA可提高hDPSC的骨再生能力。

GC是由肾上腺皮质中束状带分泌的一类激素，属于甾体类药物，具有调节蛋白质、糖、脂肪的生物合成和代谢，以及抗炎和调节细胞成骨分化等作用。地塞米松（dexamethasone，DEX）是一种人工合成的GC，常被用于牙科手术，属于甾体类抗炎药物，具有可以减少术后疼痛、肿胀和牙关紧闭等不良反应的作用[50]。此外，DEX作为一种骨诱导剂在各类细胞培养中具有诱导其成骨分化、加速成骨细胞成熟的作用[51]。Moretti等[52]通过对比研究探究了DEX在hDPSC的原代培养中是否具有骨诱导作用，实验结果表明：DEX对hDPSC具有促进成骨分化的作用。倍他米松（betamethasone）为DEX的同分异构体，也是一种甾体类抗炎药物，同时具有诱导细胞成骨分化的作用。Wang等[53]研究了倍他米松对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激的hDPSC的抗炎作用及其相关机制，评估倍他米松对hDPSC的成骨/成牙分化作用，结果表明：倍他米松通过阻断核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活化，对LPS刺激的hDPSC具有抗炎作用，并对hDPSC表现出骨/牙本质诱导作用。

2.2.3 降糖药物 二甲双胍（Metformin）是一种抗糖尿病的双胍类降糖药物，广泛用于治疗2型糖尿病（typeⅡdiabetes mellitus，T2DM）、心血管疾病、肿瘤等[54]。多项研究[55-56]表明：二甲双胍可促进干细胞成骨、成牙分化。Wang等[57]以含有一定质量的二甲双胍的新型树脂为载体，研究其对DPSC成牙本质分化和矿物合成的影响，结果显示：与不含二甲双胍的树脂相比，含二甲双胍的树脂不会对DPSC的细胞活性产生不利影响；含二甲双胍的树脂显著增强了DPSC牙源性基因的表达和ALP的活性，且含二甲双胍树脂上DPSC合成的矿物质的量显著增加。以上的结果表明：二甲双胍能够促进DPSC向成牙细胞分化和矿物合成。Houshmand等[58]研究二甲双胍对在双相羟磷灰石/β-磷酸三钙（hydroxyapatite/beta-tricalcium phosphate，HA/β-TCP）颗粒上培养hDPSC成骨分化的影响，结果显示：在一定条件下，二甲双胍能够显著提高hDPSC成骨标志物ALP的活性，表明二甲双胍能够促进hDPSC的成骨分化。

3 展望

综上所述，DPSC具有自我更新能力强、表型稳定、低免疫原性以及多向分化的生物学特性，此外，还兼具来源广泛、取材方便、适宜低温冻存等优点。在成骨向分化方面，相比于其他干细胞，DPSC的成骨分化具有成骨更多、高效、可控等特性。因此，DPSC作为组织再生及细胞治疗的种子细胞，在异体牙髓/牙本质再生、骨组织工程等领域具有广阔的应用前景。目前，DPSC可应用于受损牙本质与骨组织的修复，能构建出如牙本质-牙髓复合体、骨-软骨复合体等组织。众多研究表明：药物调控DPSC成骨分化具有普遍适用性，其可与DPSC联合应用于骨缺损的治疗，研究成果能够迅速进行临床转化，具有重要意义。相应药物可通过PI3K/Akt[30]、EGFR-MAPK-Runx2[36]、NFκB[53]、wnt/β-catenin[59]、MAPK[60]和p38MAPK[61]等通路调控DPSC成骨分化，相关通路的明确有利于对其他新药物进行筛选，更高效地调控DPSC成骨分化。

但就目前的国内外研究现状而言，药物在调控DPSC成骨分化方面还存在一定的局限：1）作用机制尚不完全明确，未来仍需对其进行更加深入的探究，最大地激发DPSC的成骨潜能；2）使用药物诱导DPSC进行成骨分化，无法对生成组织的形态进行调控。支架材料对于干细胞的黏附、增殖、分化具有重要作用，是组织工程学的新兴研究领域，其可调控生成组织的形态。因此，将药物与支架材料联合应用于诱导DPSC成骨分化，会使这一问题得以解决，进而更好的应用于临床治疗。

虽然药物调控DPSC成骨分化具有一定的局限性，但相信随着对组织工程领域越来越深入的研究，这些问题将得以解决。未来选择DPSC作为种子细胞，以药物为主体对其进行诱导分化，不仅可以使骨组织再生变为可能，而且将促使DPSC参与到组织工程学的更多领域，为其今后的临床应用提供更多可能。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。