H7N9 亚型禽流感疫苗研究进展

梁少波，张 琳，朱俊峰，刘 朔，彭 程，尹 馨，李金平，侯广宇，刘华雷，格日勒图，蒋文明

（1.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2.内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特 010018；3.山东农业大学，山东泰安 271018；4.青岛农业大学，山东青岛 266109）

禽流感（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种急性、高度接触性人兽共患传染病[1]，根据致病率不同可分为高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI），其中H7N9 亚型对禽呈现高致病性[2]。1878 年意大利首次报道AI 疫情，后来被证实为H7 亚型[3]。2000—2012年H7 亚型流感全球流行，涉及中国、德国、美国、南非、韩国、墨西哥、澳大利亚、葡萄牙等多个国家。2013 年H7N9 亚型流感在我国部分活禽市场暴发，仅仅数月蔓延至多个省份，直接经济损失达65 亿元[4]。此次疫情导致养禽业停滞，禽产品消费份额急速下降，引起了社会各界的广泛关注。同年，在上海市发现人H7N9 亚型流感病例，随后在浙江、江苏、福建、广东等地也陆续发生人感染病例[4]。2017 年初Shi 等[5]从广东省活禽市场收集的样本中检测到H7N9 亚型流感病毒HA 突变株，研究发现此类突变株对鸡具有高致病性，并且对人同样具有致病性。2017 年H7N9 亚型流感疫情席卷全国，达到疫情暴发最高峰[6]。2019 年3 月辽宁省发生孔雀H7N9 亚型流感疫情，3 月下旬内蒙古出现人H7N9 亚型流感确诊病例，这是停止报告14 个月后人间病例的再次出现[7]。2019 年Jiang 等[8]在进行主动AI 监测时，鉴定出7 株高致病性H7N9 亚型流感病毒，分析发现所有分离的病毒与往年明显不同，提示病毒的变异速度可能在加快。

针对禽间H7N9 亚型流感疫情，2017 年农业部批准使用（H5+H7）二价灭活疫苗，疫情因而得到有效控制。但近些年H7N9 亚型流感病毒变异速度加快，导致疫情防控难度加剧，至今疫情仍有发生。近年来，许多科研工作者对不同类型的AI 疫苗进行了探索和尝试，包括全病毒灭活疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒（VLP）疫苗、流感通用疫苗等。

1 全病毒灭活疫苗

全病毒灭活疫苗具有安全性高、制作工艺简单、病毒易于培养、免疫原性高、不出现变异、便于运输储存等诸多优点，目前在我国市场应用非常广泛。

2014 年国家禽流感参考实验室选取H7N9亚型流感病毒A/Chicken/Shanghai/S1053/2013（CK/53）为亲本毒株，利用反向遗传技术构建出一株H7N9 亚型流感毒株（rCK/53）作为疫苗候选毒株；2017 年以H5N1 Re-8 株和H7N9 H7-Re1 株疫苗种毒为基础，研制出重组禽流感病毒（H5+H7）二价灭活疫苗（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株，简称H5+H7 二价灭活疫苗）。吴姣姣等[9]对该疫苗进行了安全性和有效性评估，发现其对鸡、鸭和鹅均可提供良好的临床保护。2018 年，陈晓涵等[10]将疫苗株进行更新，构建了H5 亚型Re-11 株、Re-12 株和H7 亚 型 H7-Re2 株，利 用Re-11、Re-12 和H7-Re2 株疫苗种毒制备成重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（H5N1 Re-11 株+H5N1 Re-12 株+H7N9 H7-Re2 株），并证明其具有良好的免疫保护效果。该疫苗从2019 年开始在全国推广应用。2020 年刘艳晶等[11]对重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗（细胞源、H5N1 Re-11 株+Re-12 株、H7N9 H7-Re3 株）进行了评估，发现细胞源重组禽流感病毒（H5+H7）三价灭活疫苗具有良好的免疫原性，能够完全抵御近期监测到的H7N9 亚型及H5N1、H5N6 亚型流感病毒的攻击。

流感毒株的不断变异，导致疫苗毒株需要随之更新，否则全病毒灭活疫苗可能无法保护新变异毒株的攻击，因此需要更新疫苗母本毒株，以实现全病毒灭活疫苗对变异毒株攻击的保护。

2 核酸疫苗

2.1 DNA 疫苗

DNA 疫苗是将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体免疫系统，从而诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答。DNA 疫苗免疫持续期长，可诱导较强的特异性体液免疫和细胞免疫，对不同亚型流感病毒具有交叉保护作用，具有与弱毒疫苗相当的免疫原性，但其在动物体内表达效率不稳定[12]。

2018 年潘俊慧等[13]针对H7N9 亚型流感病毒，构建了表达A/chicken/Guangxi/SD098/2017 毒株（GX/SD098）HA 蛋白的重组质粒pCA-SD098，同时通过背靠背的优化方法，利用双表达框策略构建了共表达H7N9 和H5N1 亚型流感病毒HA 蛋白的双价DNA 疫苗质粒pCA-GZ4-SD098，并对构建好的DNA 质粒进行免疫效力评价，发现pCASD098 能够100%抵御H7N9 亚型流感病毒的致死性攻击，双价DNA 质粒pCA-GZ4-SD098、质粒pCA-SD098 和pCA-GZ4 混合免疫，能同时对H7N9 和H5N1 亚型流感病毒的致死性攻击提供100%的保护，因而有效降低了感染后的病毒载量。目前已证明，DNA 疫苗具有安全性高、耐受性好、免疫原性好等优点，可获得较高的HI 和中和抗体效价，足以应对流感毒株攻击，可对动物起到稳固的保护作用[12，14]。

2.2 RNA 疫苗

RNA 疫苗是将含有编码抗原蛋白的RNA 导入人或动物体内直接进行翻译，形成相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生特异性免疫应答，以达到预防免疫作用。Kapil 等[15]将H7N9 亚型流感病毒（A/安徽/1/2013）HA 蛋白mRNA 进行修饰后制备成mRNA 疫苗，结果发现该疫苗在小鼠、雪貂和非人灵长类动物中产生了强烈的免疫应答，诱导产生了较高的HI 抗体，单剂量免疫即可保护小鼠免受致命性攻击，并可降低雪貂的肺部病毒滴度。该试验证实了mRNA 疫苗具有良好的免疫原性和不受种属差异限制的优点。与传统疫苗相比，mRNA疫苗具有很多优势[16]：其一，mRNA 没有潜在的感染风险，并且可在体内降解，由此确保了疫苗的安全性；其二，mRNA 翻译效率高，可诱导高效的免疫应答反应，并可重复接种；其三，mRNA疫苗体外转化率高，可提升mRNA 疫苗生产速率，因而更具市场竞争力。

3 亚单位疫苗

亚单位疫苗是将流感病毒的基因，如HA/NA等蛋白基因，克隆到基因表达载体上，利用微生物、哺乳动物等表达系统来产生具有免疫原性的蛋白，然后通过一系列纯化得到高纯度蛋白，最后加入佐剂制成的。这种疫苗具有很好的安全性，但是免疫原性较低，需要加入佐剂才能刺激机体产生高水平抗体。很多研究已经证明了亚单位疫苗可以产生高滴度的抗体，抵御流感病毒的致死性攻击[17]。它的局限性也很明显，重组亚单位疫苗需要找到一个好的表达系统，而表达出具有抗原性的高产蛋白更为关键。因此，高质量的疫苗需要成熟的技术支持才能得以应用推广。

Hasan 等[18]采用电子逆向疫苗策略，设计了一种针对H7N9 亚型流感病毒的独特嵌合亚单位疫苗。首先筛选出最具抗原性的蛋白质组表位，然后将一个高免疫原性表位与合适的佐剂和连接剂相结合，最后利用反向遗传技术，开发出一种独特的针对H7N9 亚型流感病毒的嵌合亚单位疫苗。经验证，此疫苗理化性质稳定，能够诱导机体产生细胞免疫应答。

4 VLP 疫苗

VLP 是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的颗粒，由表达病毒结构蛋白的细胞自行组装形成。VLP 模拟了天然病毒的构象表位，具有免疫原性，可诱导产生免疫应答，具有良好的安全性，但其不含病毒核酸因而不能自主复制。目前VLP 常用的表达系统有杆状病毒、昆虫细胞、细菌、植物和衍生系统。2019 年Breanna 等[19]研制了基于流感病毒HA 蛋白的植物来源VLP 疫苗，发现小鼠肌内注射后可引发体液和细胞免疫反应，保护老龄小鼠免受致命攻击，并且此疫苗采用喷鼻方式免疫，即可获得较好的免疫效果。2020 年李如梦等[20]选取了一株H7N9 亚型流感病毒A/Chicken/Guangdong/GD15/2016（DG50）作为目的基因供体，构建出基于重组杆状病毒昆虫细胞悬浮培养系统的H7N9 VLP 新型疫苗。免疫效力试验显示：该VLP 疫苗能够诱导产生较强的免疫反应，针对H7N9 亚型流感病毒攻击可提供完全的临床保护且抑制排毒[19]。VLP 疫苗具有生产周期短、制备成本低、安全性高等特点，但其不能100%抑制排毒，使其目前未能应用于临床，是一种非常具有开发潜力的流感疫苗。

5 通用流感疫苗

流感病毒主要抗原HA 和 NA 的漂移特性，使得HA/NA 变异速度极快，因此流感防控异常艰难。就国内H7N9 亚型灭活流感疫苗，从2013 年至今，疫苗株已更新了两次。而通用流感疫苗是一种不依赖HA 和NA，对甲型及乙型流感毒株均具有保护力的新型疫苗[21]，可降低流感防控难度。目前，通用流感疫苗的几个靶点主要包括HA 的保守茎部、基质蛋白2（M2）以及离子通道的胞外域（M2e）、核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）[22]。M2e 和HA 柄结构域是通用流感疫苗设计中最广泛使用的病毒靶标。它们的保守性和受特异性抗体保护，使其免受异源病毒影响。Daria 等[23]证实了基于M2e 和HA 柄结构域的通用流感疫苗，能诱导产生针对流感病毒保守表位的抗体和T 细胞免疫反应。王文娟等[24]基于NP 和M1 蛋白合成了通用型甲型流感疫苗，免疫小鼠后可以诱导产生较强的体液及细胞免疫应答，用甲型流感A/Beijing/501（H1N1）株、A/PR/8/34（H1N1）株和A/Ostrich/Suzhou/097/2003（H5N1）株进行致死性攻击后，疫苗免疫组保护率分别为100%、100%和67%，并能降低小鼠肺组织的病理损伤和小鼠组织病毒滴度。可以产生交叉免疫保护作用的流感“通用疫苗”对AI 的防控有重要意义，而且流感通用疫苗可在很大程度上降低养殖成本和疫苗研发投入，应用于临床疫病防疫一劳永逸。

6 小结

2013 年H7N9 亚型流感疫情在我国发生，出现人间感染病例。2017 年H7N9 亚型流感毒株由低致病性变异为高致病性，给家禽业造成了重大经济损失。鉴于H7N9 亚型流感造成的公共卫生事件及其对家禽的影响，2017 年农业部批准使用（H5N1 Re-8 株+H7N9 H7-Re1 株）二价灭活疫苗，使AI疫情得到有效控制。目前针对禽间H7N9 亚型流感，我国仍采取监测、扑杀及全面接种疫苗的综合防控策略[25]。在疫苗研究方面，针对新型疫苗，如核酸疫苗、亚单位疫苗、VLP 疫苗等国内科研人员进行了不断探索和尝试，并取得了一定进展。相信，随着疫苗研究的不断深入，多种新型疫苗会不断投放市场，这将对我国H7N9 亚型流感的控制和根除起到积极作用。