牛病毒性腹泻/粘膜病研究进展

杨德新， 王新庄， 闫 磊， 朱小洁， 赵玉玺，， 薛永康， 刘晓曼， 张 震*

(1.河南农业大学动物医学院，郑州 450002；2.河南省奶牛生产性能测定中心，郑州 450046；3.河南省奶牛健康养殖国际联合实验室，郑州 450046；4.河南省种牛遗传性能测定中心，郑州 450046；5.华中农业大学动物科学技术学院,动物医学院，武汉 430070)

牛病毒性腹泻/粘膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)是感染牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)所引起的一种复杂疾病。该病是以发热、黏膜糜烂溃疡、白细胞减少、腹泻、免疫耐受与持续感染、免疫抑制、先天性缺陷、咳嗽、造成怀孕母牛流产、产死胎或畸形胎为主要特征的一种接触性传染病[1]。该病不仅致病机制复杂，而且缺乏有效的治疗手段，给养牛业造成了巨大的经济损失，因此农业部发布公告将BVD定为三类疫病，世界动物卫生组织(OIE)也将其设为B类传染病。我国研究人员李佑民在1980年首次在吉林省发现BVD/MD并分离出BVDV毒株，到目前为止至少有20多个省检测到BVDV血清抗体阳性或者分离得到BVDV毒株[2]。此病毒不仅能够感染牛，还能感染其他40多种动物，目前已确定有8种动物还可以发生BVDV持续性感染，持续性感染(PI)是造成该病毒快速传播的重要因素。近年来，随着养牛业的发展和国外牛只的进出口，BVDV在全世界范围内广泛流行，造成的经济损失不可估量[3]。BVD见于世界许多国家，美国BVDV的阳性率为51%，加拿大为82%～84%，澳大利亚高达88%，南美六国平均为85%，法国为76%[4]。本文简述了牛病毒性腹泻病毒生物学特性、流行情况以及诊断方法和防控，旨在为进一步研究和治疗提供参考。

1 牛病毒性腹泻病毒的生物学特性

牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、羊边界病毒(Border disease virus，BDV)同属于黄病毒科(Flaviviridae)、瘟病毒属(Pestivirus)，是一种长度为12.3～12.5 kb的单链阳性RNA病毒，此病毒与CSFV、BDV在血清上可有交叉反应。BVDV的基因型与基因亚型众多，不同的基因型感染牛后所表现的临床症状不同，但是共有症状为腹泻、发热等呼吸道症状。根据BVDV的5′-UTR、Npro基因和E2蛋白的核苷酸序列差异，可分为BVDV-1型和BVDV-2型。2004年，欧洲学者在从巴西进口到欧洲的胎牛血清中分离到HoBi-like病毒，但在当时并未得到国际上的广泛认可；2009年，典型的牛的瘟病毒被定义为Ⅲ型BVDV病毒，国际上也逐渐出现了关于BVDV-3型的报道。通过遗传进化分析将BVDV-1型进一步分为21个亚型(1a-1u)，BVDV-2型分为4个亚型(2a-2d)。根据它们在细胞培养中的生长特性，可以分为致细胞病变型(CP)和非致细胞病变型(NCP)[5]。这两个生物基因型的血清学相同，但是对宿主细胞的作用不一样，CP生物型会破坏组织培养，而NCP生物型则不会。在自然环境中NCP型毒株比CP型毒株多，但CP型BVDV的致细胞病变作用与该病毒的毒力之间并没有联系。

2 牛病毒性腹泻的流行

2.1 国外流行情况

牛病毒性腹泻的传播速度很快，对美国、加拿大等畜牧业发展水平高的国家，带来了严重的损失。自20世纪80～90年代开始，经统计在美国和加拿大BVD/MD的阳性检测率为50%～85%，在法国约为76%，在巴西为15.1%～56%，在克罗地亚为79.6%，在澳大利亚和新西兰约为89%，在印度约为12.5%[6]。BVDV为多种基因型共存，地域性差异明显。在美国，主要流行BVDV-1a、1b和BVDV-2a亚型[7]，澳大利亚、新西兰主要为BVDV-1c亚型。

2.2 国内流行情况

随着畜牧业的发展和进出口的频繁，我国各地也相继出现了本病的报道。曲萍等[8]在新疆、青海、宁夏、甘肃、四川5省调查BVDV流行情况，发现新疆、青海、宁夏、甘肃、四川地区BVDV阳性率分别为85.62%，31.86%，84.24%，58.93%和31.78%。魏伟等[9]在2006—2008年对黑龙江省不同地区的4个奶牛养殖场进行检测，结果显示，3年的平均BVDV血清阳性率为58.50%。在我国几乎所有省份都存在BVDV感染的情况，但是并没有引起重视和采取有效的防控措施，从而导致BVDV快速上升。我国从20世纪90年代就开始研制疫苗，但由于成本及有效性等原因并没有投入使用[10]。

3 牛病毒性腹泻的临床类型

3.1 持续性感染

NCP型BVDV产生的非溶质感染和逃避宿主免疫应答的能力是持续性感染存在的主要机制。当NCP生物型BVDV在胎牛早期感染时，胎牛的未成熟免疫系统尚未形成足够的免疫应答，在出生以后就会携带BVDV病毒。胎牛的免疫系统会识别到病毒是它的组成部分，只要它还活着，病毒就会留在犊牛体内，从而产生PI牛。PI牛出生看起来很正常，但是生长发育慢，会感染许多正常的小牛。持续性感染的牛终生都会排出病毒，甚至是其他动物的一种感染源，因此清除PI牛是控制该病毒传播的重点。

3.2 急性感染

虽然PI牛是传染牛群BVDV的重要病源，但随后的病毒传播和观察到的临床疾病是急性感染的结果。BVDV可感染胃肠道肌肉层和黏膜下层的神经结，导致正常神经功能破坏，造成感染牛腹泻。临床表现为食欲下降，精神沉郁，高热、流鼻涕、流涎、咳嗽、口腔鼻镜出现溃烂，腹泻严重，病情严重时可见血便，急性脱水死亡[11]。急性感染还会造成感染母牛流产、产木乃伊胎等症状。

3.3 粘膜病

这种临床病理综合征发生在母牛怀孕早期，此时母牛感染NCP型BVDV，导致产生可持续感染(PI)牛，持续感染(PI)牛再感染CP型BVDV可能会引起病变发生致死性粘膜病[12]。粘膜病的特点是死亡率高，动物通常在临床症状出现后1～2周内死亡，尸检显示胃肠道不同部位的粘膜有糜烂和溃疡现状。

4 牛病毒性腹泻病毒的诊断

病毒的检测和鉴定主要分为病原学检测、血清学检测和分子生物学检测3个方面。本文以病毒的分离、酶联免疫吸附试验(ELISA)、实时荧光定量PCR技术3种常用诊断为基础，展开对牛病毒性腹泻病毒诊断技术的阐述。

4.1 病毒分离

相对于其它诊断方法而言，病毒分离是病毒学诊断的“黄金标准”，该方法主要采集患病动物组织器官，接种至单层牛肾细胞，盲传几代后并不断观察是否发生细胞病变，将病毒从病变细胞中分离出来。这种方法操作效果较好，准确性较高,但是细胞的敏感性、样品储存时间长短、样品的运输方法、培养液的量和细胞的数量等因素都会影响病毒分离的结果。

4.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)

酶联免疫吸附试验是把已知的抗原和抗体包被在载体上，在载体上进行抗原抗体结合反应，通过测定吸光度来判断的一种检测方法。该方法操作简单，具有快速、特异性高、成本低等特点，特别适合一些养殖场进行大规模的检测。目前主要应用在牛病毒性腹泻病毒检测的方法主要有间接ELISA法、双抗原(体)夹心ELISA法、间接Dot-ELISA法等。赵月兰等[13]利用BVDV的重组E2蛋白作为包被抗原，建立了用于检测抗BVDV抗体的间接Dot-ELISA，与IDEXX HerdChek BVDV抗体ELISA试剂盒同时测试来自田间奶牛的100份血清样品的抗BVDV抗体，结果显示间接Dot-ELISA的特异性强，灵敏度和准确度高。胡俊英[14]应用分子生物学技术扩增及大肠杆菌原核表达系统表达了E2重组蛋白，并以此制备出了抗E2结构蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体，建立了基于单抗捕获BVDV抗原的双抗体夹心ELISA方法。葛玉凤等[15]采用原核表达方法对BVDV-E2基因中免疫原性强的一段序列进行截短表达，获得了具有良好反应活性的重组E2蛋白，以重组E2蛋白为包被抗原建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。检测结果显示，此方法具有简单快速、敏感性特异等优点。

4.3 实时荧光定量PCR

在过去的10年中，实时荧光定量PCR作为一种常规的诊断BVDV的方法得到了广泛的应用[16]。该方法可通过内参或外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。任亚初等[17]根据BVDV的E2基因保守序列，设计合成一对特异性引物，建立了检测BVDV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果表明，此种方法与能感染奶牛的其它几种病毒均无交叉反应，检出敏感度达4.87×10-1copies/μL，比常规PCR检测方法高10倍。李佳暖等[18]在BVDV 5′端非结构蛋白区域设计了1对特异性引物，用来检测BVDV、PEDV、SRV、TGEV等，同时建立了牛病毒性腹泻纳米PCR检测方法，该BVDV纳米PCR具有较高的敏感性和特异性，是一种高效的检测手段，可应用于流行病学调查。李健友等[19]利用金纳米颗粒材料与传统PCR技术相结合，针对BVDV 5′-UTR保守序列设计引物，建立了BVDV Nano-PCR新型分子检测方法，结果表明，建立的BVDV Nano-PCR方法可以用来对临床样品进行快速诊断和鉴定，具有特异性高、灵敏度好、快速稳定的优点。

5 牛病毒性腹泻的防控

对于BVDV的防控措施主要有捕杀持续性感染动物和接种疫苗，欧美一些国家已经实施了BVDV的净化方案，主要有淘汰持续性感染牛、疫苗接种和加强监测。BVDV普遍存在，致病机理复杂，我国对BVDV的研究尚浅，没有形成系统的研究体系，再加上我国BVDV毒株的基因型呈现逐渐增多的趋势，导致我国并没有开始对BVDV进行净化[20]。

5.1 牛病毒性腹泻的预防

定期为牛群接种疫苗，在牛怀孕后注射抗生素，提高牛的机体免疫能力。国内有BVDV灭活疫苗，对发病严重的牛群，每隔3～5年免疫1次；对于种公牛可在配种前再接种1次，这样多数都可以获得免疫能力[21]。随着对BVDV致病机理和流行病学知识的积累，控制该病的核心就是清除牛群中PI牛，PI牛是BVDV的高效传播者。将患病牛隔离，避免与健康牛的密切接触而发生交叉感染[22]。PI动物需要进行2次检测才可以确定，第1次检测确定为抗原阳性后，与健康牛群分开喂养，间隔21 d后进行再次检测，结果为阳性，则立即进行扑杀或淘汰。加强日常管理，保持牛群饲料充分，提高牛舍的通风质量，减少疾病的发生速率。在BVDV高发季节，对牛舍进行定期消毒，可以有效的减少腹泻的发生率。

5.2 牛病毒性腹泻的治疗

5.2.1 西药治疗 清理病牛肠道，对于一些病情严重的病牛采用高锰酸钾溶液清理。因为病毒性腹泻会使病牛迅速脱水，所以进行适当的体液补充是必不可少的，葡萄糖、地塞米松可以有效缓解病牛脱水症状，病牛病情缓解时要继续隔离，并观察无复发后才可放归牛群养殖[23]。

5.2.2 中药治疗 目前，中药作为一种预防、治疗、诊断疾病的物质，在抗病毒方面的优势成为我国研究的热点，并表现出良好的前景。2017年，宋泉江[24]选择外周血单个核细胞(PBMC)研究连翘酯苷A对BVDV的作用，发现在BVDV侵染过程中，连翘皂苷可调节CD28/细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的表达水平与INF-γ的过度分泌，促进共刺激分子的表达，提高肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF-2)、免疫球蛋白2a (IgG2a)和IL-2的表达，促进T细胞激活从而抑制BVDV复制引起的外周血单核细胞(PBMC)凋亡。通过此项研究表明，中药在抗BVDV过程中具有较好的成效。越来越多的治疗牛病毒性腹泻的实用性药方被发现，例如白芍散复方(白芍、车前子、地榆炭、金银花、滑石、大黄、白头翁、茯苓、甘草)、白芍汤复方(赤芍、黄苓、黄连、木香、大黄、金银花、连翘、茯苓、白术、甘草)[25]。

6 小 结

牛病毒性腹泻病毒结构复杂，受地域影响较大，虽只有两种常见基因型，但却有20多种不同亚型。随着国际间进出口贸易的增加，牛病毒性腹泻在全球范围内都在大量增加，不仅造成了严重的经济损失，也对该病的检测和预防带来了挑战，特别是PI牛的产生，更加重了该病的传播，因此对持续性感染牛的检测和淘汰刻不容缓。通过了解牛病毒性腹泻流行情况、临床类型和检测技术，对于该病的预防和防控具有重要意义。