丁苯酞对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后B细胞淋巴瘤/白血病-2基因及其相关X蛋白表达的影响

揭育东　林冬融

【摘要】 目的：觀察丁苯酞（Butylphthalide）对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bax）表达的影响，研究在糖尿病合并急性脑卒中患者的治疗中，丁苯酞所发挥的作用机制。方法：选取70只雄性SD大鼠，以简单随机数字法分为治疗组（n=30）、对照组（n=30）及假手术组（n=10）。三组以无菌链脲佐菌素腹腔内注射使实验动物达到糖尿病标准。假手术组切开右侧颈部皮肤，分离右侧颈动脉后，重新缝合皮肤;治疗组及对照组以栓线从右侧颈内动脉入口栓塞右侧大脑中动脉实现大脑中动脉闭塞及再灌注。再灌注30 min后，治疗组以80 mg/（kg·d）丁苯酞剂量灌胃，对照组及假手术组给予等量食用麻油灌胃，连续给药3 d。再灌注后72 h进行神经功能评分，最后以TUNEL法计算细胞凋亡数目，免疫组化检测Bcl-2及Bax表达。结果：治疗组神经功能评分低于对照组（P<0.05）;治疗组的凋亡细胞数少于对照组（P<0.05）;治疗组的Bcl-2表达高于对照组，而Bax表达低于对照组（P<0.05）。结论：丁苯酞对糖尿病合并急性脑梗死患者脑缺血半暗带中神经细胞凋亡的抑制作用可能是通过上调Bcl-2及下调Bax表达而实现。

【关键词】 丁苯酞 糖尿病 脑梗死 B细胞淋巴瘤/白血病-2 B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白

[Abstract] Objective： To observe the effect of Butylphthalide on the expressions of Bcl-2 and Bax with focal cerebral ischemia-reperfusion injury in diabetes rats and to study the mechanism of Butylphthalide in the treatment of diabetic patients with acute stroke. Method： A total of 70 male SD rats were selected and divided into treatment group （n=30）， control group （n=30） and sham operation group （n=10） by simple random number method. The three groups were injected intraperitoneally with sterile Streptozotocin to make the experimental animals reach the diabetic standard. In the sham operation group， the skin of the right neck was cut open and the right carotid artery was separated， then the skin was re-sutured. In the treatment group and the control group， the right middle cerebral artery occlusion and reperfusion were achieved by embolizing the right middle cerebral artery from the right internal carotid artery entrance. 30 min after reperfusion， the treatment group was given 80 mg/ （kg·d） Butylphthalide by gavage， and the control group and sham operation group were given the same amount of edible sesame oil by gavage for 3 consecutive days. Neurological function score was performed 72 h after reperfusion. Finally， TUNEL method was used to calculate the number of apoptosis cells. Immunohistochemistry was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax. Result： The neurological deficit score of the treatment group was lower than that of the control group （P<0.05）; the number of apoptotic neurons in the treatment group was less than that in the control group （P<0.05）; the expression of Bcl-2 in the treatment group was higher than that in the control group， while the expression of Bax in the treatment group was lower than that in the control group （P<0.05）. Conclusion： Butylphthalide may protect diabetes rats from neurons apoptosis after focal cerebral ischemia-reperfusion by promoting the expressions of Bcl-2 and inhibiting the expressions of Bax.

[Key words] Butylphthalide Diabetes Cerebral ischemia-reperfusion Bcl-2 Bax

First-author’s address： The Fifth Affiliated （Zhuhai） Hospital of Zunyi Medical University， Zhuhai 519100， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.19.008

缺血性脑血管病是中老年患者常见的高致残率、高死亡率疾病。细胞凋亡是脑缺血再灌注后神经功能缺损的重要一环，同时亦是糖尿病促进脑功能损害的其中一个关键原因[1]。丁苯酞能通过抑制细胞凋亡、促进血管内皮细胞释放一氧化氮、促进缺血区血管新生、改善微血管结构和功能等机制来达到保护脑神经元的作用[2]。本研究利用动物实验方法，探讨在糖尿病合并急性脑卒中的治疗中，丁苯酞所发挥的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠70只;分组：以简单随机数字法分为治疗组（30只）、对照组（30只）、假手术组（10只）。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病造模 70只實验大鼠在实验前14 d以正常进食进水方式饲养，维持体重在250～300 g。实验前1晚禁食8 h，禁水6 h后，以左下腹腔注射5 mg/mL的无菌链脲佐菌素（STZ），剂量为2 mg/100 g。24 h后重复注射1次，剂量为3.5 mg/100 g。其后自由进水进食。7 d后选取非空腹血糖在16.7～25.6 mmol/L（尾尖外周血血糖）范围内的大鼠为造模成功的糖尿病大鼠。

1.2.2 大脑中动脉闭塞/再灌注造模 假手术组大鼠在常规备皮、消毒铺巾后，切开右侧颈部皮肤，分离右侧颈动脉后，重新缝合皮肤，以制造假手术状态。治疗组及对照组实验大鼠MCAO/R模型参照Zea-longa法制作，以栓线栓塞右侧颈内动脉，术后2 h将栓线外露残端抽出退回至颈总动脉以实现再灌注[3]。再灌注30 min后，治疗组将丁苯酞稀释于食用麻油中，以80 mg/（kg·d）剂量灌胃，连续给药3 d;对照组及假手术组于同样时间给予等量食用麻油灌胃。

1.2.3 神经功能评分 所有大鼠在手术后以正常进食进水方式饲养，治疗组及对照组于脑缺血2 h并再灌注后72 h进行评分。0、1分表现为大鼠四肢活动完全正常或仅左侧上肢伸展欠佳，未达到造模成功标准。2分及以上表示造模成功，表现为大鼠左侧肢体抵抗力下降、提尾行走或自行行走时仅右侧肢体能活动，身体向左侧转圈或对刺激无反应。造模成功的大鼠于均于再灌注后72 h取脑进行下一步实验。以上评分均按照Bederson 6级5分制为标准[4]。

1.2.4 凋亡细胞数检测 采用TUNEL法，凋亡细胞的标志为在显微镜下可见神经细胞核内出现棕黄色颗粒。凋亡细胞的计算方法：在显微镜下选择右侧大脑中动脉供血区缺血半暗带区内互不重叠的5个显微镜视野，计算凋亡细胞的算术平均值。

1.2.5 免疫组化检测Bcl-2及Bax表达 Ⅰ抗分别为Bcl-2 Rabbit mAb及Bax Rabbit mAb，阳性细胞的标志为细胞胞浆呈棕黄色。检测方法：随机选取缺血半暗带区视野，以CanonD90数码相机用统计焦距进行拍摄，所得图片用MiVnT显微生物图像分析系统检测透光度，以平均灰度级为单位，阳性率越高，则染色越深，透光率越低，其平均灰度级数值越低。取其算术平均值用于统计。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 治疗组及对照组均出现不同程度的左侧肢体活障碍或对刺激无反应等表现，评分均在2分及以上，其中治疗组的神经功能评分低于对照组（P<0.05）。假手术组大鼠四肢活动能力及抗阻力均正常，对刺激反应良好，无神经功能缺损表现，评分均为0分。见表1。

2.2 凋亡细胞计数 治疗组及对照组大鼠的右侧大脑中动脉供血区缺血半暗带中均可见数量不等的凋亡细胞，其中治疗组凋亡细胞数低于对照组（P<0.05）。假手术组大鼠无脑梗死坏死病灶及缺血半暗带，所有标本视野中仅见极少量正常生理状态下的凋亡细胞。见表1、图1。

2.3 Bcl-2及Bax表达 假手术组Bcl-2及Bax表达极低。治疗组及对照组均可见Bcl-2及Bax表达，并且该两组Bcl-2及Bax表达均低于假手术组（P<0.05），其中治疗组Bcl-2表达水平高于对照组，同时，治疗组Bax表达水平低于对照组（P<0.05）。见表1、图2、图3。

3 讨论

目前在我国，脑血管病已成为导致死亡病因的第一位，糖尿病合并急性脑梗死在中老年患者中亦为常见[5]。在合并糖尿病的脑缺血患者中，血糖的高低与缺血性脑血管病的后预后密切相关[6]。细胞凋亡是脑梗死引起神经功能缺损的重要一环，同时亦是糖尿病促进脑功能损害的其中一个关键原因[1，7]。Bcl-2和Bax是一对抑制凋亡和促进凋亡的基因组，二者存在于线粒体、内质网及核膜内，在生理及病理状态下互相作用，共同参与细胞凋亡的过程[8]。Bcl-2和Bax镶嵌在线粒体膜上，线粒体内膜上同时存在着非特异性通透性转运孔（PTP）这一结构，在正常生理状态下能阻止细胞色素C（Cyt C）从线粒体进入胞浆。Bax是促凋亡基因的代表，能开放PTP，使Cyt C进入胞浆，与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）的前体结合活化caspase-9，进而激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3），引起细胞凋亡[9]。Bcl-2则是抑制凋亡基因的代表，其作用正好与Bax相反，其能封闭Bax形成PTP的活性，使诸如Cyt C等凋亡因子不能自由通过线粒体膜，还能通过阻止caspase活化，中断caspase级联反应，从而保护细胞免于凋亡[10]。实验研究还表明，Bcl-2和Bax通过形成同源或异源二聚体对神经细胞的凋亡起到调控作用[11]。Bcl-2/Bax的比值越大，细胞的存活率越高，反之，则存活率越低。

静脉溶栓治疗及血管内取栓治疗已成为目前公认急性缺血性脑血管病最有效的治疗方法[12]，但以上两种治疗方法都有严格的治疗时间窗和禁忌证，致使在临床上不能广泛应用于大部分于急性缺血性卒中患者。国家缺血性卒中登记处的一项调查表明，只有1.6%的急性缺血性卒中患者能够及时地接受rt-PA溶栓治疗[13]。因此，临床上急需一类没有严格时间窗限制、适应证广、能有效保护神经元，同时能显著降低糖尿病患者缺血性卒中后致残率的药物。丁苯酞的化学全称为消旋-3-正丁基苯酞（dl-3-n-Butylphthalide，NBP），又名芹菜甲素，能通过促进血管内皮细胞释放一氧化氮、促进缺血区血管新生、改善微血管结构和功能从而增加缺血后脑灌注[14-15]。有研究发现，丁苯酞能促进脑缺血再灌注小鼠海马磷酸化蛋白激酶B及Bcl-2的表达，通过抑制缺血半暗带内线粒体释放细胞色素C和凋亡诱导因子，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9的活化，下调c-Jun氨基末端激酶（JNK）和P38的表达，从而抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖性凋亡通路和非半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶依赖性凋亡通路，达到阻断凋亡过程的作用[16-17]。在临床多中心随机双盲对照研究显示，丁苯酞治疗组与对照组相比，患者的肢体活动功能、语言功能等神经系统功能得到显著恢复[18]。同时，针对合并2型糖尿病的急性脑梗死患者，丁苯酞可促进神经功能恢复、改善患者病后生活能力，经《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》推荐用于治疗急性脑梗死[19-20]。

在本實验的糖尿病大鼠中，治疗组的神经功能评分及凋亡细胞数均低于对照组（P<0.05），治疗组Bcl-2表达水平高于对照组，Bax表达水平低于对照组（P<0.05）。

综上所述，丁苯酞对糖尿病合并急性脑梗死患者脑缺血半暗带中神经细胞凋亡的抑制作用可能是通过上调Bcl-2及下调Bax表达而实现。

参考文献

[1]房亚兰，杨楠，赵咏梅，等.大黄酚对局灶性脑缺血再灌注小鼠缺血半暗带区HIF-1α与VEGF表达的影响[J].首都医科大学学报，2021，42（2）：219-224.

[2]陈雯，齐迎春，王玉伟，等.螺内酯对肢体缺血再灌注心肌损伤高迁移率族蛋白B1与Toll样受体4信号通路的影响[J].中华老年心脑血管病杂志，2021，23（4）：413-416.

[3]王丹姝，燕柳艳，孙姝婵，等.葛根素通过TLR4/Myd88/NF-κB抑制NLRP3炎症小体抗大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].药学学报2021，56（1）：1-17.

[4]谭永丽，唐慧洁，田苑.Nrf2/ARE信号通路在吗啡预处理减轻盐酸多柔比星诱导心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制[J].中国临床解剖学杂志，2021，39（2）：161-168，173.

[5]金莲锦，胡春阳，李罡，等.右美托咪定抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤研究[J].中国医学创新，2021，18（9）：29-33.

[6]陈琰琰，张业昊，徐立，等.通络清脑注射粉针对脑缺血-再灌注损伤大鼠的脑保护作用及神经元自噬相关蛋白表达的影响研究[J].中国全科医学，2021，24（15）：1951-1958.

[7]丁永学，张昊，孔垂泽，等.阿司匹林通过抑制NF-κB信号途经减轻缺血再灌注肾损伤[J].解剖科学进展，2021，27（2）：226-229.

[8]方彦玲，许丽萍，连超炜，等.西格列汀对糖尿病大鼠胰岛β细胞CXCL10及其受体表达的影响[J].中国医学创新，2021，18（2）：22-26.

[9]程岑，顾尔伟.舒芬太尼后处理对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志，2019，28（7）：603-608.

[10]邹悦，李金容，唐兴江.6-苄氨基嘌呤预处理对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的干预效果及机制[J].广西医学，2019，41（12）：1532-1535，1548.

[11]李金容.缺血后处理对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后海马区SOCS-3及TNF-α表达的影响[D].泸州：西南医科大学，2019.

[12]何婧.利拉鲁肽通过激活PPARs改善糖尿病大鼠局灶性脑缺血损伤[D].遵义：遵义医科大学，2019.

[13]宋程光，闵鹤鸣，杨鑫，等.原花青素对2型糖尿病局灶性脑缺血大鼠脑组织半胱氨酸蛋白酶3表达的影响[J].中国基层医药，2019，26（6）：693-696.

[14]林冬融，揭育东，韩江全.尤瑞克林对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12表达的影响[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2019，26（1）：20-24.

[15] Zhang P，Guo Z F，Xu Y M，et al.N-Butylphthalide（NBP）ameliorated cerebral ischemia reperfusion-induced brain injury via HGF-regulated TLR4/NF-κB signaling pathway[J].Biomed Pharmacother，2016，83：658-666.

[16]岳赛超，郭付有，孙逸杰，等.米诺环素对大鼠脑出血后细胞凋亡及Dickkopf-1、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白和B细胞淋巴瘤/白血病-2表达的影响[J].中华实验外科杂志，2019，36（1）：90-93.

[17]林冬融，揭育东，韩江全.尤瑞克林对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注后细胞色素C及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3表达的影响[J].遵义医学院学报，2018，41（4）：424-430.

[18] Wang S，Ma F，Huang L，et al.Dl-3-n-Butylphthalide（NBP）：A Promising Therapeutic Agent for Ischemic Stroke[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2018，17（5）：338-347.

[19] Zhou M，Wang H，Zeng X，et al.Mortality，morbidity，and risk factors in China and its provinces，1990-2017：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J].Lancet，2019，394（10204）：1145-1158.

[20]彭斌，吴波.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018[J].中华神经科杂志，2018，51（9）：666-682.

（收稿日期：2021-05-31） （本文编辑：田婧）