腺苷酸激酶4在恶性肿瘤中的研究进展*

牛良晨 综述 李力 审校

腺苷酸激酶（adenylate kinase，AK）是一种广泛存在的催化核苷酸磷酸化交换反应的酶。迄今为止，已在脊椎动物中鉴定出8 种AK 家族同工酶（AK1～AK8）［1］，它是一个单体磷酸转移酶，催化可逆磷酰基转移反应，调节细胞内ATP 浓度。AK 的表达形成一个完整的信号网络，连接能量的需求/供应和代谢过程。AK通过将末端磷酸基团从ATP转移到腺嘌呤核糖核苷酸（adenosine monophosphate，AMP），形成两个腺嘌呤核苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）分子，参与核酸合成和细胞能量代谢［2］。AK 大量存在于高能源需求的细胞质中，病理情况下可溶性AK的活性高度特异性上调［3］。AK 亚型（AK1、AK2、AK4、AK6）在调控肿瘤细胞代谢、代谢信号以及细胞迁移和侵袭等方面发挥重要作用。在肿瘤初始阶段，多种因素抑制AK磷酸化转移和AMP生成，进而通过腺苷酸-活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信号传导，AK→AMP→AMPK 通路信号的下调可导致细胞周期、生长和增殖失去控制［4］。AK4在缺氧耐受、抗肿瘤药物耐药、调节线粒体活性等方面也发挥重要作用［5-6］，并被用作抗癌治疗的潜在靶点。例如，AK4表达水平可以通过调节线粒体活性来影响抗癌药物的敏感性［7］。尽管对基本功能进行了广泛的研究，但其与肿瘤之间的AK4 关系尚未得到进一步的探索。疾病的发生发展都伴随着能量代谢的改变，因此，对AK4的研究可以有助于了解疾病的病理机制，同时为临床治疗提供新方法、新思路，尤其是对恶性肿瘤的治疗有重要意义。

1 AK4的基本功能和作用机制

人类AK4 基因于1992年被鉴定［8］，是腺苷酸激酶家族的第四种酶，目前认为其主要在心、肾、肝等富含线粒体的组织中表达［9］。Noma等［10］通过电泳分析测得AK4 的分子量为29 kDa，并测得多个AK4 转录本，其最长的转录本大小约为8.0 kb，在肾脏和心脏中表达最高，在肝脏中中度表达，在大脑中弱表达，而在胎盘和肺中，AK4 mRNA 几乎检测不到。进一步的亚线粒体分馏表明AK4 位于线粒体基质中，这是线粒体靶向信号的特征［10-11］。AK4 被认为是特异性地作用于能量代谢，而不是控制体内腺嘌呤核苷酸的平衡［12］。在Khatri等［13］的研究中，已知AK4参与了代谢的调控，并且AK4 的表达明显与转录调控和代谢过程有关。据报道，缺氧条件下培养胚胎肾细胞，应激反应蛋白AK4 的水平有所增加［14］，提示AK4 可能在细胞缺氧耐受中发挥作用。Synnergren等［15］研究发现AK4重叠表达于表皮衍生细胞和心脏祖细胞中，在低氧暴露24小时后，AK4在该两种细胞中被上调，进一步证实AK4 在细胞的缺氧耐受中发挥作用。但实验均为体外细胞模型，其结果说服力有限。而在HEK293 细胞中针对AK4 的RNA 干扰（RNA interference，RNAi）可抑制增殖，促进凋亡；该研究同时表明，在缺氧条件下HepG2 细胞的AK4 水平降低，细胞增殖明显减少，细胞凋亡增加。因此，AK4 水平的降低与细胞凋亡相关［16］。该结果可推测不同的AK4 水平反映了不同的基础压力水平，从而导致细胞对额外压力的不同反应。国内有研究表明，AK4在张氏肝细胞中高表达，而沉默AK4后细胞增殖速度显著降低，细胞周期阻滞在S期，G2期细胞明显减少［17］，可推测促进细胞增殖是AK4 的基本功能之一。AK4被确定为线粒体RNAi筛查中细胞ATP水平的关键调节器，敲除AK4 使ATP 水平提高25%以上同时降低ATP/ADP 比值；AK4 可能通过感知线粒体ATP/ADP比值和调节腺苷酸转位酶（adenine nucleotide translocase，ANT）的转运活性来维持线粒体腺嘌呤核苷酸池；AK4 敲除可以诱导AMPK 的产生，表明AK4 的正常功能会影响细胞中AMPK 的激活［6］。总之，上述研究表明AK4调节细胞能量电荷和AMPK的激活，是细胞内稳态的重要调节因子。

有报道称AK4与线粒体基质上的ADP/ATP转位子和电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）相互作用，从而调节线粒体膜通透性和线粒体基质与细胞间ADP/ATP 交换［14］。AK4可能通过与ANT/VDAC 复合物相互作用，调节电子传递链（electron transport chain，ETC）产生的活性氧外排，从而提高细胞内活性氧水平，促进有氧糖酵解，减少体内细胞缺氧坏死［18］。研究表明，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）蛋白的含量随着AK4 表达的减少而减少，降低了细胞对EGFR 抑制剂的敏感性［19］。该研究先利用生物信息学系统对AK4 基因特征进行分析再以实验验证，使结果更有说服力。总而言之，AK4不但在细胞基本生理功能中发挥作用，在细胞病理过程中也扮演重要角色。

AK4在大脑中的高表达，提示其与大脑功能密切相关。有研究利用靶向蛋白质组学定量分析率先发现，AK4 与认知功能下降有关，且其作用无法用阿尔兹海默症病理或其他病理学解释［20］。其随后的研究证明，AK4 的丰度越高，认知衰退更快，但AK4 蛋白与老年人运动功能无关［21-22］，该研究利用了大量临床标本，使结果更加可信，但并未进一步证明AK4与认知功能之间的关系。其他方面，Wang 等［23］发现AK4亦是机械敏感基因，骨细胞中AK4 的表达对重力和高磁场的改变非常敏感。因此，对AK4 基因的研究将有助于了解骨量丢失的机制，为预防和治疗骨量丢失或骨质疏松症提供潜在的靶点。Tang等［24］研究发现在系统性红斑狼疮-诱导多能干细胞中，AK4蛋白和其mRNA 被上调，合成代谢普遍加速，这可能导致系统性红斑狼疮；Edhager 等［25］发现AK4 蛋白参与的能量重编程、细胞存活和增殖等，与短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症和相关代谢紊乱有关。总之，虽然对AK4 有了初步认识，但其相关研究较少，具体作用机制仍不清楚，有待开展更多更深层次的研究。

2 AK4对恶性肿瘤发生发展的影响

肿瘤的发生都伴随着代谢的改变，而AK4 作为能量代谢酶，在肿瘤发生发展中的作用不言而喻。研究表明，腺苷酸激酶家族蛋白在侵袭性转化过程中异常上调［5，26］。之后有研究通过比较基因表达谱，发现AK4 在高侵袭性肿瘤中有明显的过表达［27］，因此可以认为AK4 促进了肿瘤细胞代谢，该研究为AK4 在肿瘤领域的研究奠定了基础。AK4 是参与多种肿瘤发生发展的关键酶，并被用作抗癌治疗的潜在治疗靶点［28］。AK4 提高细胞内活性氧水平可促进体内肿瘤细胞的转移，且可以施加反馈调节缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），而AK4-HIF-1α 正反馈环操作取决于细胞内活性氧水平，该反馈环会稳定HIF-1α蛋白质和诱导上皮间充质转变（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）；在缺氧条件下AK4 增加HIF-1α 蛋白表达和诱发EMT［18］。因此推测AK4可能通过两种形式促进癌症发展：一是通过增加HIF-1α表达来增加肿瘤细胞的缺氧耐受能力，二是通过增加胞内活性氧水平和糖代谢促进肿瘤细胞转移。过表达的AK4不仅能保护肿瘤免于缺氧坏死，还能增强肿瘤的转移能力，这与只有具有增强的抗氧化防御系统的肿瘤细胞才能利用氧化应激促进转移的观点一致。AK4 的过表达可能同时引发对细胞内氧化应激和抗氧化能力增加的代谢适应，进而促进HIF-1α 介导的EMT 和转移［18］。该研究利用数据库结合体内外实验，较全面地分析了AK4促进癌症进展的机制。小核仁RNA宿主基因11（small nucleolar RNA host gene 11，SNHG11）和HIF-1α 作用机制相似，SNHG11 可以与AK4 基因启动子中的HRE位点结合，增加其转录，从而增加AK4表达，促进结直肠癌的侵袭和转移［29］。Jan 等［27］的研究发现，AK4表达的缺失抑制了肺癌细胞系的侵袭潜能，而AK4过表达促进了肺癌细胞系的体内外侵袭；AK4 通过下调激活转录因子3（activating transcription factor 3，ATF3）的方式促进肺癌肿瘤生长、转移及复发；此外，当AK4 在肺癌细胞中过表达时，涉及到侵袭和转移过程的靶标基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP2）表达上调，提示肿瘤侵袭性增加，但对细胞的生长和增殖尚无显著影响，因此AK4可以作为预测肿瘤转移能力的生物标志物，可能有助于开发针对高侵袭性肿瘤的更好治疗方案。综上所述，AK4 在多数肿瘤中过表达，通过促进细胞代谢而促进肿瘤发展，且其过表达总是预示着较差的结果，因此对AK4的研究有重要的临床意义，将有助于肿瘤早期诊断和预后评判。

3 AK4对肿瘤诊断、治疗和预后的影响

随着不断发现AK4 在肿瘤发生发展中的作用，其在肿瘤领域的诊断、治疗等方面的价值亦逐渐受到人们重视。有关肺癌的研究表明，过表达AK4 与肺腺癌预后不良有关；通过将肺腺癌细胞系中AK4 mRNA的表达状态与药物敏感性数据相关联，该研究提出高水平AK4 的肺癌细胞可能对EGFR 靶向治疗敏感［19］，提示AK4或可作为抗癌治疗的增敏靶点，不足之处是该推测暂无相关试验证实。Jan等［18］的研究分析发现，AK4 可以作为一个关键因素决定HIF-1α在预测肺癌患者预后中的作用，与单独用HIF-1α相比，结合AK4和HIF-1α表达预测非小细胞肺癌患者预后更不理想。该研究提出，用withaferin-A 逆转AK4基因信号可能成为治疗转移性肺癌的新策略，为转移性肺癌的治疗提供了理论依据。有报道指出，AK4 在肺癌细胞中的表达显著升高，敲低AK4 可使肺肿瘤细胞迁移能力明显降低，同时顺铂抑制肺癌细胞增殖和促进凋亡的作用进一步增强，即耗竭AK4可抑制肺癌进展并提高肺癌细胞对顺铂的敏感性［30］，为肺癌患者顺铂耐药的后续治疗带来一线希望。在对胰腺导管癌的研究中，李辰运等［31］对临床病例及标本进行分析发现，AK4的异常表达与肿瘤分期、淋巴结转移、神经受侵、脉管内瘤栓相关，AK4的过表达提示胰腺癌患者分期较晚和预后不良。利用同样的方法，庞亮等［32］对肌层浸润性膀胱癌的研究发现，在不同性别、年龄、肿瘤分期和分级、淋巴结转移和复发的患者中AK4 表达无明显差异，AK4 仅表达于膀胱癌组织，而在癌旁组织中无表达，且AK4的表达率随肿瘤进展而增高。该研究为AK4判断膀胱癌患者预后提供了临床依据，而AK4在膀胱癌诊断、治疗中的作用仍未见报道，值得进一步研究。Xin等［33］发现AK4的表达与膀胱癌患者预后不良呈正相关，其研究结果表明AK4 可以促进细胞增殖，抑制AK4 可以降低膀胱癌的细胞活力；动物模型发现，小鼠膀胱癌细胞T24和5637中下调AK4可抑制肿瘤的形成和转移，也抑制肿瘤的增殖和侵袭；AK4 消融术在体内抑制膀胱癌的增殖和转移。该研究为AK4治疗膀胱癌提供了分子生物学的理论基础。因此，AK4可能是膀胱癌预后的潜在生物标志物，也是膀胱癌新的治疗靶点。

据报道，AK4 在HER-2 过表达型乳腺癌中呈现异常高表达，且其异常过表达提示HER-2 过表达型乳腺癌患者的TNM 高分期和淋巴结转移，提示预后不良［34］。Zhang等［35］的临床病理研究亦支持此观点，并进一步指出AK4表达与患者的年龄和肿瘤分级等特征无明显相关，体外实验表明，AK4可促进HER-2阳性乳腺癌细胞的增殖和侵袭，而AK4 消融可抑制HER-2 阳性乳腺癌细胞的增殖和侵袭。有研究表明，AK4 过度表达可增加活性氧和p38 磷酸化水平，并抑制线粒体凋亡，从而导致乳腺癌他莫昔芬耐药；而抑制AK4 表达，可使乳腺癌细胞对他莫昔芬重新敏感［36］。以上研究表明AK4在乳腺癌的发展和耐药中发挥重要作用，为乳腺癌的治疗提供了潜在靶点，因此，更进一步的临床研究十分必要。通过生物信息学分析，Wang 等［37］首次提出AK4 是子宫内膜癌的独立预后标志物，其表达与较差生存显著相关，为预测子宫内膜癌患者的生存提供了理论依据，但该分析并未加以实验验证。Lanning等［6］发现AK4表达和拷贝数与胶质瘤患者生存期呈负相关，推测AK4 是用于预测胶质瘤患者预后的潜在靶点。因此，认为AK4可以用来预测癌症患者的预后，AK4过表达提示预后较差，总生存期较短。Zang 等［38］发现AK4 基因是miR-199a-3p的靶基因，miR-199a-3p负调控AK4的表达，而AK4 的表达水平与食管癌的放疗耐药呈正相关，该研究为解决食管癌放疗耐药提供了理论依据，因此，AK4 的临床研究将会有重要的临床应用价值。Lei等［39］证明了AK4的表达水平与骨肉瘤细胞系的多药耐药有关，并推测可能受miR-199a-3p的调控，该研究进一步证明AK4 表达与骨肉瘤细胞耐药呈正相关。但是Chen等［40］在口腔癌放疗抵抗的研究结果却相反，AK4虽然促进口腔癌细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡和细胞周期停滞，但却增强了口腔癌细胞的放射敏感性。因此，AK4虽然可以促进肿瘤发展，但在不同肿瘤耐药中的作用不能一概而论。综上所述，可以推测AK4 可通过调控肿瘤细胞的增殖和侵袭而触发肿瘤的进展，这可能是过表达的AK4促进肿瘤细胞生长代谢的结果。因此，AK4可以作为降低肿瘤细胞代谢的靶点，从而干预肿瘤发展，增加肿瘤细胞对药物的敏感性，为肿瘤系统治疗带来希望。

4 小结与展望

综上所述，AK4主要通过其表达量变化参与细胞生理和病理代谢过程。在正常细胞中，AK4可以通过调节胞内ATP、活性氧等物质的浓度来调节细胞增殖和细胞内稳态；在肿瘤细胞中，AK4通过增加细胞代谢适应、增强细胞糖代谢而避免肿瘤细胞凋亡和促进其增殖。AK4在恶性肿瘤中多为过表达，虽然其表达与多数肿瘤的分期无明确关系，但是AK4 过表达可以促进肿瘤的增殖、侵袭和迁移，改变肿瘤对治疗的敏感性，且过表达多提示预后不良和生存期较短。目前的研究已表明，AK4可作为判断恶性肿瘤预后的指标；在肿瘤治疗方面，干预AK4可抑制肿瘤的增殖和侵袭，增加肿瘤细胞对药物的敏感性。AK4的研究提供了治肿瘤疗的潜在靶点，其临床价值值得更深入的研究。