牛间充质干细胞及其应用研究进展

王姝妤，叶紫芸，王春生

（东北林业大学生命科学学院，哈尔滨150040）

干细胞是一类未分化或分化程度很低的细胞，通过不对称分裂产生子代干细胞和定向分化细胞。在过去几十年中，关于细胞生物学的研究活跃，并不断取得新突破。目前，干细胞治疗有着广阔的发展前景，在个性化治疗、组织工程、慢性疾病和再生疾病缓解方面均有广泛应用。根据来源，可将干细胞分为两类：来自囊胚内细胞团的胚胎干细胞和存在于发育成熟器官中的成体干细胞。而在各类成体干细胞中，间充质干细胞具有可塑性好、免疫原性低和抗炎能力高的特点，是治疗疾病的候选细胞。间充质干细胞还能产生生物活性物质和黏附分子，有助于抑制瘢痕形成和凋亡，促进血管生成，并刺激固有祖细胞再生。因此，干细胞疗法为目前无法提供有效药物治疗的各种慢性疾病提供了潜在的解决方案[1]。本文对近年来牛间充质干细胞的分离方法与生物学特征的研究进展进行简述，并在此基础上总结了其在动物再生医学领域中的应用，为同领域的研究人员提供参考。

1 研究现状

1.1 牛间充质干细胞生物学特性

干细胞，是一种未充分分化、尚不成熟的细胞，具有再生为各种组织器官和人体细胞的潜在功能。目前，对于MSC的特性没有一个普适性定义，也没有分离和培养程序标准。由于缺乏细胞特异性标记物来鉴定MSC，导致在过去一段时间内，干细胞研究进展受阻，因此国际细胞治疗学会(ISCT)建立了三个基本参数来确定MSC基本特性，即细胞贴壁生长、分化能力和表面标志分子[2]。

1.1.1 表面标记物

不论细胞来源或分离程序如何，MSC必须在表达特定的细胞特异性标记的同时缺乏造血细胞表面标志物的表达。人间充质干细胞表达CD 105、CD 73和CD 90，缺乏CD 45、CD 34、CD 14或CD11b、CD 79α或CD 19、HLA-DR表面分子的表达[3]。来自不同物种的MSC表达的标记不完全相同，来自不同组织的MSC表达的标记也不完全相同[4]。来自不同组织的牛MSC对CD 29、CD 166、CD 105、表面酶（CD 73)、受体(CD 44)、糖蛋白(CD 90)等与粘附相关的间充质标记表达均为阳性[5]。此外，牛MSC还表达OCT 4、SOX 2和NANOG[6]等多能性基因。

1.1.2 多向分化潜能

间充质干细胞负责组织的转换与补充，当组织需要修复时，这些细胞受到刺激进行增殖和分化，在特定的离体条件下，MSC还能够诱导分化为成骨细胞、皮肤细胞、肾上皮细胞和软骨细胞等广泛的功能性细胞。过去人们普遍认为MSC只能分化为中胚层（脂肪样细胞）细胞世系，近年来，有研究表明牛等物种的间充质干细胞还能分化为内胚层（胰岛B样细胞）和外胚层（神经元样细胞）[7-9]。

1.1.3 其他

在标准培养条件下，MSC表现出可塑性粘附即细胞贴壁生长特性。分离培养后，可以将集落形成单位(CFU)和群体倍增时间(PDT)作为指标分析MSC的自我更新能力。MSC具有免疫调节特性，可与B细胞、T细胞和NK细胞等免疫细胞相互作用。此外，间充质干细胞还具有免疫原性低、抗炎性强、抑制瘢痕形成、促进血管形成、刺激固有祖细胞再生等特点[10]。

1.2 牛间充质干细胞来源

牛间充质干细胞可从子宫、脐带、骨髓、脂肪组织、胎盘和羊水等多种机体组织中分离出来。

1.2.1 骨髓

目前已有多项研究成功分离牛的骨髓间充质干细胞（BM-MSC）。骨髓间充质干细胞从牛骨髓腔中分离出来并进行贴壁培养。贴壁细胞呈成纤维样；经流式细胞仪检测，这些细胞表面表达了多能标记物如OCT 4、SOX 2和NANOG，以及典型的MSC标记：CD 29、CD 90和CD 105。经体外诱导培养，BM-MSC可分化为成骨细胞，脂肪细胞等功能性细胞[11]。

在未添加任何外部生物活性因子的情况下，培养中的牛骨髓间充质干细胞会自发形成软骨细胞[12]。BM-MSC的体外培养会受到药物的影响，例如TGF-β信号通路受体ALK5的抑制剂Repsox可显著提高骨髓MSC增殖及抗凋亡能力，增强细胞多能性，诱导细胞成骨分化，降低其成软骨分化潜能[13]。

1.2.2 脂肪

脂肪源间充质干细胞(AT-MSC)呈成纤维细胞样形态，并能够分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂细胞。有研究表明，成脂分化过程中SCD1基因是影响脂肪酸组成的关键控制点，该基因的过表达可提高脂肪细胞中单不饱和脂肪酸（MUPA）的含量[14]；与BM-MSC相比，AT-MSC具有较强的促血管生成能力，较弱的增殖能力和免疫原性，二者还具有相似的迁移率和免疫调节能力[15,16]。

牛脂肪间充质干细胞传代后的潜伏期较短，在细胞汇合度较高时的接触抑制不明显。环巴胺（CPA）可以通过抑制Hedgehog通路全期抑制Cyclin蛋白表达，从而抑制AT-MSC的增殖[17]。

1.2.3 子宫

子宫内膜基质细胞(E-MSC)在个体的整个发情周期和妊娠期间呈动态生长和分化。体外培养时，子宫内膜基质细胞粘附在培养皿上，呈成纤维细胞样形态，具有较高的增殖能力，并具有分化为软骨、骨和脂肪细胞的能力。由于MSC的免疫原性低，它可以移植入异体，且不触发免疫应答。在一些研究中，牛的子宫内膜基质细胞已被分离鉴定，这些细胞呈成纤维细胞样形态，这些细胞表达CD 29和CD 44等MSC标记物，也可表达多能标记如OCT 4、SOX 2和c-kit[18]。将E-MSC放入特定的成骨培养基中培养，可迅速产生成骨细胞的特征。E-MSC在冷冻保存后依旧表现出优良的克隆性、中胚层分化潜能。最近的报道显示，所有的E-MSC均具有粘附性、高增殖能力并可以进行CD 44和波形蛋白的表达[19,20]。

1.2.4 胚外组织

在羊水、羊膜、胎盘、脐带等胚外组织中，均可以获得间充质干细胞。

由于成本低廉，操作简便且不受伦理限制，羊水成为了MSC的普遍获取部位。从羊水中分离的MSC细胞在原代培养过程中表现为异质性，从第四代开始呈成纤维细胞样形态。其表面标记物检测结果显示，羊水MSC呈CD 44、CD 73、CD 166阳性，CD 34、CD 45阴性。此外，这些细胞还表达了OCT 4，并在适当的诱导条件下，能够分化为外胚层和中胚层细胞[21]。

胎盘在妊娠期间扮演着非常重要的角色，包括营养供应、分泌激素和气体交换，分娩后胎盘很容易从母体分离。从牛胎盘中分离的细胞表达典型的间充质干细胞标记，包括CD 73和CD 166，以及多能标记物OCT 4，但不表达CD 45等造血世系标记物，这些细胞还可分化为胰岛样细胞[22]。

从脐带血和脐带组织中也可分离脐带间充质干细胞[23]。可以通过密度梯度离心的方法从脐带血中分离细胞。与骨髓等其他来源间充质干细胞相比，脐带血间充质干细胞的可用性高、免疫原性低，是干细胞的可靠来源之一。据报道[24]，与骨髓干细胞相比，脐带间充质干细胞具有较大的体积、更大的可塑性和较低的免疫原性。从脐带血中分离出的牛MSC细胞生长成单层细胞，表达了OCT 4和CD 73，并能够分化为成骨、成软骨生成和成脂肪等细胞谱系。在另一项研究中[25]，分离的牛脐带MSC细胞可传代至第32代，并表达CD 29、CD 44、CD 73、CD 90和CD 166。此外，这些细胞还能分化为成骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、胰岛细胞和神经细胞。这表明MSC有向非中胚层分化的潜能。

1.2.5 其他

除了以上来源，还可以从牛胰腺、肺、肌腱和牙等器官分离获得间充质干细胞。有研究[26]将体外培养的牛胰腺间充质干细胞（P-MSC）传至65代，生长动力学分析表明牛胰腺MSC的体外自我更新能力强，增殖能力随传代而降低，具有多向分化潜能，可被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、平滑肌细胞。表面抗原检测显示，P-MSC表达CD 29、CD 44、CD 73、CD 90、CD 106、CD 166、波形蛋白、巢蛋白和胰岛素，而CD 34和CD 45不表达。此外，胰腺MSC可在高浓度葡萄糖刺激下持续快速地释放胰岛素，为糖尿病细胞疗法和组织工程提供了一个重要选择。

观察组：行益气养阴消积饮联合NC化疗治疗，即在NC化疗的基础上行益气养阴消积饮治疗，即：选择剂量为10 g的麦冬和千蟾皮、剂量为12 g的海藻和百部、剂量为15 g的北沙参、太子参、八月札、瓜蒌和莪术，剂量为20 g的鱼腥草以及剂量为30 g的山海螺、生牡蛎、仙鹤草和薏苡仁，然后使用300 mL的水煎服，1剂/d（分早晚2次服用），连续用药60 d[1]。

有研究分离了牛胎肺间充质干细胞（FL-MSC），免疫荧光染色和RT-PCR结果表明牛FL-MSC表达CD 29、CD 44、CD 73和CD 166，而CD 34、CD 45和Bola-DRα不表达[27]。

1.3 牛间充质干细胞的培养条件

骨髓组织经酶解后粘附在塑料基质培养板上，细胞“爬出”且呈现MSC特征。Gazit等的研究[28]表明，胶原酶处理骨髓组织后，容易分离出脂肪组织源的MSC。胶原酶分解胶原纤维，“切断”了细胞之间的连接，这是分离MSC常用的方法之一。然而在分离过程中需摸索酶的最佳浓度、孵育时间和温度。

获得MSC可以使用不同实验方案。将组织块粘附在培养皿上48～72 h后进行传代是目前常用且有效的做法，但这种方法通常会导致细胞产生异质性。为了获得一致性好的MSC，有人提出了更严格的分离实验方案，包括使用不同的培养基、流式细胞分选和粘附在培养皿上3 h后立即传代等。

为了使细胞能够在体外存活、增殖和保持分化能力，培养系统须模仿原始组织的条件。这些细胞须在含5% CO2的恒温培养箱中，以便在培养基中维持适合的pH值、含氧量，同时提供最佳生理温度。

胎牛血清在细胞培养液中，能够支持MSC在培养板上的附着和增殖。不同浓度的FBS会对MSC产生不同影响，高浓度下的MSC免疫原性降低而增殖速率增加；低浓度下的MSC免疫原性增加而增殖速率下降；极低浓度时，免疫原性和增殖速率皆下降[29]。添加适宜浓度的血清替代物（KSR）可以促进牛间充质干细胞的增殖速率，缩短增殖周期。而使用较高浓度的KSR替代FBS则会引起细胞增殖停滞[30]。

加入适量的生长因子可以促进MSC的增殖：如TGF-β1在适宜浓度和时间(2 ng/mL，24 h)下可以减少细胞凋亡，并且使得BMSCs的细胞迁移能力和正常核型率显著提高。在TGF-β1作用下，细胞的多能性相关基因（Sox2和Nanog)和间充质标志物(N-cadherin和Fn1)的表达水平显著上调。此外TGF-β1还能激活EMT过程，显著提高EMT相关基因（Snail和Slug）的表达水平，维持BMSCs的细胞特性[31]。

有研究[32]表明，低氧环境或许可以维持间充质干细胞的特性：缺氧(5%氧)时可以促进bBMSCs的集落形成和应激纤维合成，提高细胞迁移能力与正常核型率，使细胞极性减弱，核型稳定性增强。此外，低氧时HIF-TWIST信号通路轴相关基因的表达水平上调，进而维持bBMSCs的间充质特性。

1.4 牛间充质干细胞的应用

1.4.1 乳腺炎

临床乳腺炎对乳房组织影响严重，会显著降低产奶量。MSC的抗炎特性可以降低乳腺炎给动物机体带来的损伤，经治疗剂修饰的干细胞也可用于治疗乳腺炎。据报道，将克隆牛乳铁蛋白(LFcinB)基因导入pggyBac转座子载体，通过外源表达的杂合抗菌肽是一种可行的治疗方法[33,34]。

1.4.2 糖尿病

牛的糖尿病类似于人类的青少年糖尿病，会使动物血液和尿液中的葡萄糖水平升高，影响其肝脏中脂肪酸的合成，从而引起酸碱失衡、中毒和脱水，严重时或导致昏迷和死亡。目前发现骨髓间充质干细胞可转化为胰岛样团簇，表达胰岛素和胰高血糖素[21,35]，减缓糖尿病的症状。

1.4.3 动物繁殖

双侧卵巢营养不良可能会引起内分泌失调、发育异常等动物繁殖障碍，严重时可能会导致无法排卵。羊水MSC具有消炎作用，且免疫原性低，可修复组织细胞，这为临床组织工程提供了新的治疗方案。有研究表明，注射体外培养的羊水MSC能促进卵泡成熟，减轻营养不良的症状，使牛恢复繁殖能力[36]。

MSC可作为核移植的理想供体细胞。核移植(NT)是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使供体细胞无需经过精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成为重构胚。重构胚经胚胎移植后，即可获得克隆动物。经过对核供体细胞适当的修饰，进行部分基因的重组，移植后的细胞就可以治疗由于细胞功能缺陷所引起的各种疾病，亦可帮助物种繁殖保留优秀遗传资源。与成纤维细胞相比，MSC分化程度低，更容易被重编程[37]。因此目前已有研究成功使用羊水间充质干细胞和脂肪间充质干细胞克隆犊牛[38]。

2 存在问题

目前，对于牛间充质干细胞的研究还存在着一些问题。主要表现如下：

2.1 牛间充质干细胞来源较少

目前，牛间充质干细胞仅可从子宫、脐带、骨髓、脂肪组织、胎盘和羊水等机体组织中分离，来源并不广泛，而且对取材的动物有一定年龄限制，若是年龄过长，可能会提取不到优质的牛间充质干细胞。

2.2 牛间充质干细胞的自我更新能力有限

牛间充质干细胞会进行自我更新有限使得其传代次数培养受限，无法长时间连续传代培养。若传代过多，例如十几代之后，可能会出现遗传不稳定，间充质干细胞功能衰退、自动分化等现象。

2.3 牛间充质干细胞的分化潜能存在争议

目前已有研究表明在培养基中加入地塞米松或三碘甲状腺原氨酸可以促进间充质干细胞分化为软骨细胞[39]。但是关于定向诱导分化的条件尚不明确，仅在将间充质干细胞分化为软骨、脂肪等细胞上有较为明确的方式[40]，在间充质干细胞分化为其他特异性组织细胞的研究还很少，结果并不丰富，无法归纳出系统性的诱导方式。

2.4 牛间充质干细胞的临床应用研究偏少

目前仍然缺少有力的临床数据来证明牛MSC的功能。比如：已有部分实验和临床数据为使用MSC治疗糖尿病提供了支持[41]，但是治疗糖尿病的临床数据还需要进一步研究来积累结果；尽管已有实验表明牛MSC可以促进骨骼肌肉的再生过程[42]，但目前尚无临床数据表明间充质干细胞可用于牛骨修复[43]；MSC分泌的信号分子和营养因子可以调节天然免疫反应，从而治疗牛慢性关节炎，但依旧缺乏相关的数据支撑。

3 解决对策

3.1 从多种机体组织中广泛分离牛间充质干细胞

可以从多种组织中提取细胞，尝试分离牛间充质干细胞。间充质干细胞主要存在于各种结缔组织以及器官的间质中，在骨髓和脂肪组织中含量最丰富，而如今投入研究的却多是骨髓间充质干细胞与脐带血间充质干细胞。因此可以从动物的其他组织分离培养间充质干细胞，为今后的研究拓宽道路。已经有人在牛舌中分离出了间充质干细胞[44]。可以尝试从肌肉与胰腺等组织中分离提取牛间充质干细胞，拓展间充质干细胞的来源，为肌萎缩或糖尿病等研究奠定基础。

3.2 调整分离培养方式

改变分离牛间充质干细胞的方法，目前常用的间充质干细胞分离方式为差速离心法、红细胞裂解法、二次贴壁法等等。但这些方法都有各自的缺陷，可能不适合所有种类的牛间充质干细胞，所以需要通过平行实验来探索最佳的方案。

改变培养基中化合物种类与需求量，改变培养的气体与温度情况，比如加入生长因子、激素等物质，使间充质干细胞的特性得以长期维持。

3.3 深入研究牛间充质干细胞分化机制

构建多组平行实验，通过改变诱导物的种类与剂量，探究牛间充质干细胞分化的机制。目前已经有研究[45]表明生长分化因子可以诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化。但是还没有人研究牛间充质干细胞的分化机制，以及不同细胞因子和信号通路在调控骨髓间充质干细胞分化中的作用。可以尝试使用不同细胞因子比如生长激素、生长分化因子等进行对照实验，探究其对间充质干细胞生长分化的影响，分析其在分子水平的作用。

3.4 加大临床试验获取更多数据

增加资金与人力投入，展开对于牛间充质干细胞的临床应用研究。推广间充质干细胞治疗的方式与方法，宣传牛间充质干细胞在医学方面的优势，让更多的研究者了解到间充质干细胞的应用前景，鼓励越来越多的人参与到该研究中。

4 结 论

MSC被认为是再生医学中很有研究前景的细胞。牛MSC可从不同组织中分离。来源不同，MSC细胞表达的标记物也不完全相同，不同MSC的分化潜能和临床作用有待进一步研究。但间充质干细胞已经应用于治疗退行性疾病、改善创后、功能恢复和改良遗传资源等领域。相信随着研究的不断深入，牛间充质干细胞必将创造更大的价值。