弥漫性大B细胞淋巴瘤基因分型研究进展

祁昱 徐晓莹 张会来 综述 孟斌 审校

弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lym⁃phoma，DLBCL）是来源于B 淋巴细胞、具有高度侵袭性的恶性增殖性疾病，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%。DLBCL 在临床表现、细胞起源、分子遗传学特征以及预后等方面均呈现明显异质性。基于基因表达谱（gene expression profiling，GEP）分析并参照细胞来源（cell of origin，COO），可以将DLBCL 分为生发中心B细胞样（germinal center B-cell-like，GCB）和活化B 细胞样（activated B-cell-like，ABC）两个主要分子亚型，以及少量介于两者之间的第三型。虽然目前标准一线免疫化疗R-CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松）方案的普及应用显著改善了DLBCL 的疗效，但仍有约40%患者出现初治耐药/难治或病灶消退后短期复发，尤以ABC 亚型预后较差［1-2］。而在基于COO 分型进行的R-CHOP 联合伊布替尼、硼替佐米和（或）来那度胺等“R-CHOP+X”的临床试验中，患者生存并无明显改善［3］。提示需要在基因层面对DLBCL 进行更深层次的研究，探索更为精细的分子分型，为寻找新的药物和更加精准的治疗方法提供线索。有研究应用以测序为主的多平台高通量检测技术［4-8］，对大样本量的DLBCL 病例进行检测，并对相关基因的突变、拷贝数变异、染色体易位及基因表达等异常进行了综合分析，从不同方面提出多种DLBCL 的分子分型，虽然成果还不能直接应用于临床诊疗，但对于深入理解DLBCL 的发病机制、进一步探索DLBCL 的预后相关因素和精确分层、研究开发新的靶向药物和精准诊疗方法等均具有重要的参考意义。

1 DLBCL的分子类型制

DLBCL 中存在多种重现性的基因改变，在一项涉及1 001 例DLBCL 样本的研究中共确认超过150个推定的淋巴瘤异常驱动基因［4］，也有研究发现每个病例平均含有17个基因异常［5］。这些基因突变频率多在5%～23%之间，另外还存在很多低频突变［4］，显示DLBCL 具有极高的异质性。2018年，两项研究分别通过全外显子以及全转录子测序等技术，对基因扩增、突变、拷贝数异常改变、染色体重组等基因异常改变进行聚类分析，将DLBCL分别划分为C1-C5 5个或MCD、BN2、N1和EZB 4个分子类型［5-6］。分子分型的划分对于DLBCL 发生机制的理解、靶向药物的选择具有重要意义。然而，Schmitz 的“四分型”仅能囊括46%的病例［6］，说明上述分型方法仍存缺陷。近期，有研究将“四分型”进一步细分为MCD、BN2、N1、EZB-MYC+、EZB-MYC-、ST2、A53 7 个分型，涵盖63%的病例，较“四分型”有了较大的提高［7］；在一项涉及928例侵袭性B细胞淋巴瘤的人群中对293个基因进行靶向测序，将DLBCL 划分为MYD88、BCL2、TET2/SGK1、SOCS1/SGK1和NOTCH2 5个分型［8］。尽管上述研究均涉及不同的聚类和数据分析方法，病例人群也不同，但几种分型之间具有一定的相似性。不同分子类型涉及的细胞通路和生物学特征各不相同，现将几种分子分型的基因改变特点以及针对各个分型可能有效的靶向治疗药物综述如下。

2 以ABC亚型为主的分子分型

2.1 MCD/C5/MYD88分型

研究显示，MCD/C5/MYD88分型占DLBCL的8%～13%，其中90%以上为ABC亚型患者，预后较差，髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88，MYD88）L265P位点和CD79B 突变为该分组的主要特征，核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路通过My-TBCR超复合体被活化［5，7-8］。虽然不同分型间存在异质性，但仍有部分共同的基因改变，包括TBL1X 受体1（TBL1X receptor 1，TBL1XR1）失活突变、PIM-1原癌基因（Pim-1 protoncogene，PIM1）突变，以及PR域蛋白1（PR domain containing protein 1，PRDM1）的突变或缺失［5，7-8］。另外值得注意的是，有研究发现与肿瘤蛋白P53野生型的MYD88分型患者相比，TP53突变患者预后极差，提示该分型可进一步细分［8］。

该亚型的病变常常累及结外部位，且侵袭中枢神经系统、玻璃体视网膜、睾丸、乳腺等“免疫特权”部位的频率较其他分型大大提高。Wright等［7］研究发现这一现象可能与主要组织相容性复合体Ⅰ（major histo⁃compatibility complexⅠ，MHC Ⅰ）和抗原相关处理转运蛋白1（transporters associated with antigen processing 1，TAP1）的失活，人类白细胞抗原A（human leukocyte antigen A，HLA-A）、HLA-B、HLA-C的缺失或突变，程序性死亡受体配体1（programmed cell death-ligand 1，PDL1）和程序性死亡受体配体2（programmed cell deathligand 2，PD-L2）表达增加，以及CD58截短突变等有关。这些基因异常改变可导致T细胞和NK细胞的激活减少，从而使肿瘤细胞逃避免疫监视。

近期，研究发现MCD/C5 亚型起源于记忆B 细胞，并揭示其发生机制，TBL1XR1突变可导致SMRT/HDAC3 复合物不能与Bcl-6 结合，而与BTB 及CNC同源基因2（BTB domain and CNC homolog 2，BACH2）的结合增强，从而使浆细胞分化所需的PRDM1 的表达被抑制，生发中心B细胞向记忆B细胞转化。该研究还发现MYD88L265P 和CD79B 突变以及自身抗原刺激等使B 细胞受体（B-cell receptors，BCRs）途径活化、干扰素调节因子4（interferon regulatory factor 4，IRF4）表达增加，活性化胞苷脱氨基化酶表达水平增高以及其介导的“脱靶”突变进一步增多，这些改变导致细胞增殖能力增强、PIM1等基因突变累积，使记忆B细胞最终转化形成MCD/C5型DLBCL［9］。

MCD/C5/MYD88 分型的上述特点有助于针对性选择相关的靶向药物。近年的一项临床试验发现MYD88L265P 合并CD79A/B 突变的ABC 亚型患者应用布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton's tyrosine kinase，BTK）抑制剂伊布替尼的有效率达80%，而MYD88 单独突变的患者无法从BTK 抑制剂中获益，提示该分型患者采用BTK抑制剂或R-CHOP联合BTK抑制剂进行治疗可能从中获益［10］；有研究发现PIM1 突变可上调NF-κB 上游信号TLR4/7 的表达，L2V、P81S、S97N 位点的突变可降低ABC-DLBCL 细胞系对依鲁替尼的敏感性［11］，说明PIM1和BTK抑制剂联用在治疗MCD/C5/MYD88 分型上的可能性；鉴于TBL1XR1 突变中SMRT/HDAC3 复合物的作用，或提示HDAC3 抑制剂可能对该分型患者有效［9］。

2.2 N1分型

有研究将以NOTCH1 受体1（notch receptor 1，NOTCH1）获得性突变为特征的一组病例归类为N1分型，占DLBCL 的1.7%，其中ABC 亚型患者约占90%，且预后较MCD/C5/MYD88 分型更差，其他基因改变还包括ID3、BCOR和IKBKB等，参与B细胞的分化调节、激活NF-κB通路等［6-7］。

3 以GCB亚型患者为主的分子分型

3.1 EZB/C3/Bcl-2分型

EZB/C3/Bcl-2分型约占DLBCL的23%，其中约95%为GCB-DLBCL 患者，主要特征为Bcl-2（B-cell lym⁃phoma-2）易位和zeste 基因增强子的人类同源基因2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）的激活突变［5，7-8］。此外，TNF受体超家族成员14（TNF receptor superfamily member 14，TNFRSF14）缺失或突变、赖氨酸甲基转移酶2D（lysine methyltransferase 2D，KMT2D）突变、CREB结合蛋白（CREB binding protein，CREBBP）缺失或突变、IRF8 突变以及肌细胞增强因子2B（myocyte enhancer factor 2B，MEF2B）的突变也是该分型的重要特征，上述基因参与基因组甲基化或乙酰化，或作为转录因子，通过抑制抗体类别转换、调控Bcl-6以及PRDM1等基因的表达来促进淋巴瘤的形成［10，12-13］。Lacy等［8］研究发现该分型中TP53突变患者预后明显更差，因此可根据TP53改变情况将该分型进行进一步筛选。

研究发现，EZH2 突变细胞系对EZH2 抑制剂Tazemetostat更为敏感［14］，且LYSAⅠb期临床试验显示Tazemetostat安全性良好［15］，提示EZH2抑制剂可能对EZB/C3/Bcl-2分型有效；CREBBP通过调控增强H3K27乙酰化来促进基因表达，这些基因同时被Bcl-6/SMRT/HDAC3复合物去乙酰化调控，CREBBR功能缺失使这一平衡被打破，抑制HDAC3可恢复那些因CREBBP功能缺失而被抑制的基因表达。因此，HDAC3抑制剂可能针对EZB/C3/Bcl-2分型患者有效［16］；有研究发现，对于Bcl-2过表达且TP53为野生型的细胞系，Bcl-2抑制剂联合MDM2-TP53信号通路抑制剂可明显抑制肿瘤生长，为TP53野生型的患者提供了一种新的治疗方向［17］。

一类形态学和遗传学介于DLBCL和伯基特淋巴瘤（Burkitt lymphoma，BL）之间的淋巴瘤被称为高级别B细胞淋巴瘤（high grade B cell lymphoma，HGBL），2016年世界卫生组织（WHO）淋巴瘤分型将HGBL 同时伴有MYC、Bcl-2和（或）Bcl-6染色体重排的淋巴瘤称为双打击或三打击的高级别淋巴瘤（HGBL-double hit/triple hit，HGBL-DH/TH）［18］。研究发现，HGBL-DH/TH中发生Bcl-2重排的患者（HGBL-DH/TH-Bcl-2）均为GCB亚型，尽管GCB亚型患者经R-CHOP治疗预后相对较好，但HGBL-DH/TH-Bcl-2患者预后通常较差，可能需采用DA-EPOCH-R（剂量调整的依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、阿霉素联合利妥昔单抗）等强化化疗方案［19］。因此，重新认识这类预后较差的分组并将其区分十分必要。

Ennishi等［20］通过比较HGBL-DH/TH-Bcl-2与其他GCB-DLBCL之间的分子差异，设计出一个包含104个基因的分型工具“DHITsig”，可将GCB亚型中预后较差的一组进行筛选。Sha等［21通过比较多个芯片中DLBCL和BL的基因表达，开发出一个可区分DLBCL和BL的分类方法，并将其应用于REMoDL-B临床试验纳入的DLBCL患者中，发现9%患者可被该分类方法识别，具有BL样的特征，该研究将这组DLBCL定义为“MHG”淋巴瘤，该分组将包括双打击淋巴瘤在内的预后较差患者规模扩大一倍，且90%病例为GCB亚型［22］。“DHITsigpos”和“MHG”分型具有一定相似性，两种分型划分出的病例预后较其他GCB亚型患者更差，其中发生MYC、Bcl-2和（或）Bcl-6重排的患者仅约占50%，且两种分型均存在MYC过表达和MHCⅡ低表达或缺失、免疫反应较弱、CD4+T细胞浸润水平明显较少的现象；观察基因突变谱发现两分组基因改变具有一定相似性，均存在KMT2D、Bcl-2、TP53、MYC、EZH2、DDX3X的突变［20，22］。说明GCB亚型中确实存在一组不能仅靠“双打击”或“三打击”进行区分的预后较差的分子亚型。

鉴于EZB亚型绝大部分为GCB-DLBCL，Wright等［7］将“DHITsig”和“MHG”分组与基因分型联合分析发现，约70%EZB可以被划分为“DHITsig-pos”，且“DHITsig”仅在EZB亚型中具有预后意义，由此可见EZB亚型与“DHITsig”之间存在紧密联系。根据MYC是否出现重排、扩增以及突变，EZB分型可以划分为EZB-MYC+和EZB-MYC-两组，分别对应EZB-DHITpos 和EZBDHITneg。研究发现EZB-MYC+和EZB-MYC-的基因改变存在不同，其中EZB-MYC+组常见TP53突变或缺失、DDX3X突变、叉形头转录因子1（forkhead box O1，FOXO1）突变，而EZB-MYC-组则常出现TNFα诱导蛋白3（TNF alpha induced protein 3，TNFAIP3）和半胱天冬酶募集结构域家族成员11（caspase recruitment domain family member 11，CARD11）的突变以及TP73的缺失［7］。

HOVONⅡ期临床试验发现，来那度胺联合R-CHOP治疗可显著提高MYC重排患者的预后［23］，Dunleavy等［24］研究发现与R-CHOP治疗相比，接受DA-EPOCH-R治疗的MYC重排患者预后明显提高，提示EZB-MYC+患者可采用R2CHOP（利妥昔单抗、环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松联合来那度胺）、DA-EPOCH-R等治疗方案。溴结构域和超末端结构（bromodomain and extraterminal，BET）蛋白BRD4通过募集转录调节复合物来调控MYC的表达，Li等［25］研究显示，BET抑制剂可降低双打击细胞系的增殖水平，且联合Bcl-2抑制剂具有显著的细胞杀伤能力；此外，还有研究显示，对于Bcl-2抑制剂venetoclax耐药的双打击细胞系，联用BET抑制剂可以通过下调BFL-1/MYC的表达来克服耐药［26］，提示EZB-MYC+组单用BET抑制剂以及联合Bcl-2抑制剂的可能性，但上述研究仍集中于细胞水平，还需要更多的临床试验进行验证。

3.2 C4和SOCS1/SGK1分型

C4和SOCS1/SGK1分型约占DLBCL的13%，其中GCB亚型约占80%，预后较好［5，8］。其基因表达谱与原发纵隔大B细胞淋巴瘤相似，主要的基因异常改变包括血清/糖皮质激素调节激酶1（serum/glucocorticoid reg⁃ulated kinase 1，SGK1）突变、细胞因子信号转导抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）突变、CD83突变、HIST1H1E 突变、以及NFKB 抑制因子α（NFKB inhibitor alpha，NFKBIA）的突变［5，8］。该分型中多条信号通路被激活：Orlacchio等［27］研究显示，SGK1的突变与PI3K/AKT通路的激活有关；Liau等［28］研究发现，SOCS1失活突变可活化JAK/STAT信号通路；NFKBIA突变与NF-κB信号通路有关。因此，与上述通路有关的分子靶向药物可能对该分型有效［5］。另外，Zhou等［29］研究发现，接受R-HCVAD（利妥昔单抗联合环磷酰胺、美司钠、阿霉素、长春新碱、地塞米松、甲氨蝶呤、阿糖胞苷）或R-EPOCH（利妥昔单抗联合依托泊苷、泼尼松、长春新碱、环磷酰胺、阿霉素）治疗的原发纵隔大B细胞淋巴瘤患者预后较R-CHOP治疗明显提高，提示C4和SOCS1/SGK1分型患者可根据情况选择强化方案进行治疗。

3.3 ST2和TET2/SGK1分型

ST2 和TET2/SGK1 分型以GCB-DLBCL 为主，预后较好，甲基胞嘧啶双加氧酶2（TET methylcytosine dioxygenase 2，TET2）合并SGK1的突变是该分组的主要特征［7-8］。除此之外，两分型共同的基因改变还包括P2Y 受体家族成员8（P2Y receptor family member 8，P2RY8）基因的突变［7-8］。这些异常变化有利于更好地理解该分组的生物学特征：SGK1突变与PI3K活化有关［27］，P2RY8突变与AKT活化有关［30］，因此针对PI3K/AKT通路的抑制剂可能对该分组有效；TET2参与基因组甲基化的过程，截短突变已被证明与小鼠生发中心B 细胞淋巴瘤生成有关，TET2 缺失可导致基因组异常高甲基化，导致PRMD1等基因表达下降，提示DNA 甲基转移酶抑制剂（DNA methyltransferase inhibitor，DNMTi）等恢复基因组超甲基化的抑制剂在尝试治疗该分组患者上的可能性［31］。

4 混合ABC和GCB亚型患者的分型

4.1 BN2/C1/NOTCH2分型

BN2/C1/NOTCH2 分型约占DLBCL 的13%，其中ABC、GCB 和第三型各占33%左右，以Bcl-6 易位和NOTCH2突变为特征，预后一般［5，7-8］。基因表达谱与边缘区淋巴瘤相似，其他主要的基因改变包括SPEN突变、TNFAIP3截短突变、CD70突变、Bcl-10突变或扩增以及跨膜蛋白30A（transmembrane protein 30A，TMEM30A）的截短突变。

该分型中NF-κB信号通路通过TNFAIP3缺失以及BCL10扩增被激活，CD70突变可能减弱T细胞和NK细胞之间的相互作用，这些有利于更好的理解这一亚型的生物学特征［7］。Ennishi等［32］研究表明，TMEM30A突变患者预后较好，对化疗药物更加敏感，TMEM30A缺失小鼠中肿瘤相关巨噬细胞增多且CD47抑制剂对肿瘤的抑制作用明显加强，提示新的免疫检查点抑制剂可能对该分型有效。

4.2 A53/C2分型

A53/C2分型以TP53的突变和缺失为主要特征，约占DLBCL的6%，其中ABC亚型患者约占60%，GCB患者约占30%，预后较好［5，7］。此外，染色体片段的反复获得与缺失在该分型中也极其常见，涉及17p、3q、1q的缺失以及21p、11q的获得等［5，7］。

核输出蛋白（exportin 1，XPO1）参与蛋白从胞核向胞质输出，与P53、P73等多种肿瘤抑制蛋白的功能失活有关，XPO1抑制剂Selinexor可以抑制P53等蛋白的核输出来恢复其抑制肿瘤和生长调节的作用［33］。SelinexorⅠ期临床试验中，复发/难治性DLBCL 的总有效率为51%［33］，且Ⅱ期临床试验表明Selinexor不良反应可控，是一种可口服的非细胞毒性药物［34］，提示Selinexor可能是A53/C2分型的一种针对性药物。

5 结语

DLBCL作为一种异质性极强的肿瘤，以往的COO分型已不能满足实际的临床需要，根据COO分型进行设计的临床试验也未能取得理想结果。基于基因改变对DLBCL进行亚型划分是大势所趋，目前的“五分法”以及“七分法”分类方法有助于更好地理解DLBCL的发生发展过程，筛选出预后可能较差的人群，从而预见性地使用强化化疗方案，或针对性地选择伊布替尼、硼替佐米、来那度胺等靶向治疗药物，从而改善患者预后。然而，目前基因分型的研究仍有很大的局限性，测序费用高、数据分析繁杂等原因限制了其实际应用，因此仍需设计应用简单、针对性强的分类平台，从而为临床诊疗和患者筛选提供切实帮助。