EphA2在乳腺癌治疗耐药中作用的研究进展*

张飞 牛瑞芳

促红细胞生成素诱导肝细胞受体（erythropoietinproducing hepatocyte receptor，Eph）是目前已知的受体型酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）中最庞大的家族，人类基因中包括EphA（EphA1-A8 和EphA10）和EphB（EphB1-B4 和EphB6）两个亚家族共14 个成员[1-3]。与Eph 受体相结合的配体被称为Eph 家族受体相互作用蛋白（Eph family receptor-interacting protein，Ephrin），其中与Eph A 相结合的配体主要为Ephrin A1。该家族成员与经典RTK 如表皮生长因子受体EGFR 的配体EGF 相比，具有一个明显的不同之处，即Ephrin 均为定位在细胞膜上的分子，是一种非可溶性配体。表达Eph 受体的细胞通过与邻近细胞的膜结合配体Ephrin 相结合。因此，Ephrin-Eph 家族介导的信号传导依赖于细胞间的直接接触[2-5]。生理情况下，该家族介导的信号传导通路在调控胚胎发育和维持组织内环境稳态中发挥重要作用[6]。Ephrin-Eph 信号系统的失调与包括肿瘤在内的多种疾病的发生密切相关，目前在多种肿瘤中发现Eph 受体的表达异常，其中EphA2 表达升高与肿瘤发生发展的关系最为密切[1-4]。本文主要针对EphA2 的结构、参与介导的信号传导通路以及在乳腺癌治疗耐药中的作用进行综述。

1 EphA2 的结构及作用机制

人EphA2 蛋白由EPHA2 基因编码，该基因定位于第1 号染色体短臂3 区6 带（1p36），全长约31 768 bp，包含17 个外显子，编码蛋白的全长包含976 个氨基酸，分子量大小约130 kD，成熟的EphA2蛋白主要定位于细胞膜[4]。EphA2 在结构上是一种典型的Ⅰ型跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区构成。其中胞外区由一个N 末端的配体结合结构域，紧接着一个富含半胱氨酸的区域和两个串联的纤连蛋白Ⅲ型重复结构域构成。而胞内区则由一个近膜结构域、酪氨酸激酶结构域、SAM 结构域和一个C末端的PDZ 结合基序构成[2-4]。由于EphA2 的配体Ephrin A1 是一种通过糖基磷脂酰肌醇链（glycophosphatidylinositol，GPI）锚定在细胞膜上的分子，因此Ephrin A1-EphA2 的结合发生在相邻的两个细胞之间[4]。配体与受体结合二聚化后再进一步形成异四聚体，激活EphA2 胞内区的酪氨酸激酶活性，继而磷酸化受体上的酪氨酸残基并介导下游信号传导[3]。与经典RTK（如EGF-EGFR）通常只介导单向信号传导不同的是，Ephrin A1-EphA2 的结合能够触发一种独特的双向信号传导，即正向信号（由Ephrin A1 向EphA2 传导）在表达EphA2 的细胞中传导；而反向信号（由Eph A2 向Ephrin A1 传导）则在表达Ephrin A1 的细胞中传导[7]。这种双向信号传导模式是细胞之间接触依赖性通讯的主要形式。此外，EphA2 还能介导不依赖Ephrin A1 的正向信号传导。目前多数研究表明，依赖配体的正向信号传导往往与EphA2 的酪氨酸激酶活性有关，而非依赖配体的正向信号通路则与其激酶活性无关[3-6]。最近的研究发现，EphA2 可以表达至细胞产生的外泌体上，能够向远距离传递信号，代表了一种非依赖细胞直接接触的Ephrin-Eph 信号途径的新机制[8-9]。EphA2 参与细胞内信号传导的方式灵活多样，说明其是一个多功能蛋白，提示了Ephrin A1-EphA2 信号系统在肿瘤发生发展过程中具有非常复杂的作用。

2 EphA2 在乳腺癌中的表达以及在乳腺癌发生发展中的作用

在所有Eph 受体中，EphA2 在乳腺癌中的研究最受关注。多项研究发现，EphA2 在大约40% 的乳腺癌组织中表达升高，而且其阳性表达往往出现在三阴性乳腺癌和HER-2 阳性乳腺癌组织中[1-2，4]。临床病理学参数的分析结果表明，乳腺癌组织中EphA2 表达增高与患者出现较多淋巴结转移、组织学分级高、雌激素受体（estrogen receptor，ER）丢失和抗雌激素治疗抵抗等密切相关。预后分析表明EphA2 表达升高与患者的总生存率（median overall survival，OS）和无复发生存率（relapse-free survival，RFS）呈显著负相关；与此相一致，体外细胞学实验和小鼠体内乳腺癌模型研究发现，EphA2 常在转移能力较强的三阴性乳腺癌细胞中表达升高，而在低恶性度的乳腺癌细胞或正常乳腺上皮细胞中表达降低[10]。此外，最近有研究发现，乳腺癌耐药细胞中EphA2 的表达显著高于非耐药细胞[8]。因此，上述结果表明EphA2 表达升高在乳腺癌发生发展中发挥促进作用。

多项研究发现配体Ephrin A1 在浸润性乳腺癌组织中低表达，这一现象尤其体现在EphA2 表达较高的乳腺癌组织中[1，11]。同样体外实验也发现EphA2 表达高的乳腺癌细胞中，Ephrin A1 通常低表达甚至丢失。上述现象提示乳腺癌中EphA2 及配体Ephrin A1 的不平衡表达可能是促进肿瘤发生发展的一个关键机制[12]。目前不少证据均支持这一假设，如功能学研究发现恢复Ephrin A1 的表达能够诱导细胞中EphA2发生内吞降解，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和肿瘤的生长；反之，Ephrin A1 表达丢失则能显著促进乳腺癌的发生发展。目前这个现象在其他多种肿瘤中均得到了证实，即EphA2 非依赖配体的正向信号通路激活能够促进肿瘤发展；而依赖Ephrin A1 的正向信号通路激活则发挥抑制癌细胞增殖、侵袭和转移的作用[13-15]。与此相一致，最近一项在乳腺癌中的研究发现，肿瘤组织中EphA2-S897 磷酸化增高（配体非依赖信号通路激活的标志）与乳腺癌患者RFS 和OS 降低显著相关[16]。总之，上述研究数据支持这样一个结论，即配体Ephrin A1 表达丢失能够减轻肿瘤抑制信号，从而促进EphA2 配体非依赖的促癌信号通路激活。

3 EphA2 促进乳腺癌耐药

除了促进肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、血管生成和体内转移外，近年的一系列研究还发现，EphA2表达升高与包括乳腺癌在内的多种肿瘤的治疗敏感性降低密切相关[17-20]。如EphA2 高表达与乳腺癌内分泌治疗抵抗、化疗耐药、分子靶向治疗耐药和免疫治疗耐 受等有密切联系。

3.1 EphA2 与乳腺癌内分泌治疗抵抗

内分泌治疗是临床上激素受体阳性乳腺癌患者的主要治疗方式，耐药是导致患者死亡的重要原因。内分泌治疗的主要作用靶点是ER，而ER 的突变或丢失是导致临床上内分泌治疗失败的主要原因[21]。多项研究发现EphA2 表达增高与乳腺癌组织中ER 的丢失呈显著正相关[16，22]；相应的现象也在体外乳腺癌细胞模型研究中得到了证实[23]。提示EphA2 的表达水平可能与乳腺癌患者的内分泌治疗敏感性相关。体内外实验同样证实，乳腺癌细胞中EphA2 表达增高能降低细胞对雌激素的依赖程度，并提高细胞对他莫昔芬的抵抗能力；反之，封闭EphA2 的功能则能增强细胞对他莫昔芬的敏感性[23-24]。上述结果表明EphA2表达上调是导致乳腺癌患者内分泌治疗抵抗的重要原因之一，而抑制EphA2 或联合抑制EphA2 和ER的活性可能是一种逆转乳腺癌患者内分泌治疗耐受的策略[24]。

3.2 EphA2 与乳腺癌的化疗耐药

化疗是所有类型乳腺癌治疗最常用的手段，患者对化疗的反应与其预后密切相关。多项研究发现，化疗药物阿霉素或紫杉醇处理乳腺癌细胞能够诱导EphA2 表达升高，提示其可能为一个药物反应基因[25-26]。最近一项研究发现EphA2 在多个乳腺癌耐药细胞中表达升高，而亲本细胞则低表达或不表达，提示EphA2 可能与化疗耐药有关[8]。相应的，抑制乳腺癌细胞中EphA2 的活性能显著增强多种药物的抗肿瘤效果[27-28]。类似的现象在卵巢癌、胰腺癌、肝癌和黑色素瘤等多项研究中也得到了证实[18，20，29-30]。这些结果说明EphA2 表达升高能够降低乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。化疗耐药往往与肿瘤细胞中多药耐药蛋白泵如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的表达升高有关[31]。有研究发现EphA2 能够调控鼻咽癌细胞中P-gp 的表达[32]；而最近的研究也发现EphA2 与乳腺癌耐药细胞中P-gp 的表达呈显著正相关[8]。上述结果提示EphA2 可能通过调控多药耐药蛋白的表达促进乳腺癌细胞对化疗药物的抵抗。

3.3 EphA2 在乳腺癌分子靶向治疗抵抗中的作用

近年的一系列研究显示EphA2 表达升高与抗HER-2 分子靶向治疗的耐药密切相关[1，33]。如EphA2通过与HER-2 直接相互作用从而增强HER-2 信号通路的激活，并促进乳腺癌的发生和转移[34]；EphA2 在HER-2 阳性乳腺癌组织中表达升高与患者的无病生存率和OS 降低密切相关[33]。体内外实验证实EphA2 能够通过促进谷氨酰胺代谢从而促进HER-2阳性乳腺癌细胞的生长[35-36]。此外，EphA2 在对抗HER-2 靶向药物曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞中高表达，而抑制其表达能够恢复细胞对曲妥珠单抗治疗的敏感性[33]。类似的结果同样在HER-2 过表达胃癌的研究中得到证实，即抑制EphA2 能够显著逆转抗HER-2 靶向治疗的耐药[37]。上述结果表明EphA2过表达是抗HER-2 治疗耐药的标志之一，而抑制EphA2 有望成为逆转靶向HER-2 治疗耐药的一种策略[1，4，38]。

3.4 EphA2 在乳腺癌免疫治疗中的作用

肿瘤免疫治疗是基于激活患者自体免疫系统，杀伤肿瘤细胞从而治疗癌症的一种方式[39]。近年来，随着免疫检查点阻断疗法和嵌合抗原受体修饰的CAR-T 细胞疗法的应用，免疫治疗在多种肿瘤中取得了良好的效果，并展现了非常好的发展前景[40]。然而其在乳腺癌中的整体疗效并不理想，如能寻找到增强乳腺癌免疫治疗效果的靶点，将有助于改善乳腺癌的预后。最近一项临床前研究中，采用靶向EphA2 的脂质体紫杉醇联合程序性死亡受体-1（programmed cell death protein -1，PD-1）抑制剂能够更加显著地抑制乳腺肿瘤的生长，而且这种抑制效应具有非常好的持久性[41]。进一步研究发现，这种抗肿瘤效应与肿瘤组织中CD8+T 细胞的浸润增多有关。相对比，单纯采用紫杉醇联合PD-1 抑制剂治疗的小鼠中未观察到T 细胞浸润增多。该结果提示，肿瘤细胞中的EphA2 可能会抑制T 细胞浸润，发挥免疫抑制作用。类似的一项研究发现，与EphA2 低表达的肿瘤相比，EphA2 高表达的肿瘤组织中T 细胞浸润更少，显示更强的免疫抑制微环境；敲除EphA2 能够导致肿瘤中抗原呈递基因的表达显著上调，同时肿瘤组织中T 细胞浸润增多，并对免疫治疗的敏感性提高[42]。提示EphA2 上调是促进肿瘤内部免疫抑制的重要原因。此外，有研究表明EphA2 在肿瘤组织中表达升高还可能成为肿瘤免疫治疗的新抗原，而且靶向EphA2 的CAR-T 细胞在临床前研究中取得了良好的抗肿瘤治疗效果[43-44]。另外发现，靶向EphA2 的单克隆抗体除了能够封闭和降解EphA2 以外，还能通过激活抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）杀伤肿瘤细胞[45-47]。上述结果说明，靶向EphA2 不仅能够杀伤肿瘤细胞，还能解除肿瘤微环境中的免疫抑制，促进免疫细胞的浸润，增强免疫治疗的效果。

4 结语与展望

近年来，随着对EphA2 的功能和作用机制研究的深入，逐渐认识到EphA2 是一个在乳腺癌发生发展过程中发挥非常关键且具有复杂作用的分子。EphA2不仅有望成为一个预测乳腺癌治疗效果的分子标志物，而且还很有可能成为一个治疗乳腺癌的分子靶标。目前多项研究已经开发了多种靶向EphA2 的策略，并应用到包括乳腺癌在内的多种类型和不同阶段恶性肿瘤的临床试验中，包括靶向EphA2 的单克隆抗体和小分子抑制剂类、基于EphA2 及其配体Ephrin A1 设计的小分子多肽类、可溶性Ephrin A1 蛋白和靶向EphA2的siRNA 等。上述药物能够通过降低EphA2 的表达、促进EphA2 降解和阻断内源性EphA2 激活等多种方式发挥抗肿瘤作用。此外，能够特异识别和靶向EphA2 抗原的CAR-T 细胞已被设计出来并开始进行临床试验。另一种策略是将EphA2 的靶向抗体或多肽与细胞毒性药物偶联，这种方式能够将抗体的特异性和细胞毒性药物的杀伤作用结合起来发挥抗肿瘤作用[48-49]。一种具有发展前景的靶向策略是设计靶向EphA2 的纳米载体，向肿瘤细胞运输抗肿瘤药物[41，50]。随着上述各种治疗策略研究的进展，基于EphA2 的分子靶向治疗在乳腺癌中将具有非常好的发展前景。