中医药通过调控ABC跨膜转运蛋白逆转骨肉瘤化疗耐药的研究进展

丁聚贤 ，谢兴文，许伟，李鼎鹏，李宁，苏积亮，柳博，李建国，柴利军

0 引言

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）好发于青少年以及儿童，是临床最多见的原发恶性骨肿瘤，常见部位为四肢关节附近，早期易出现肺转移，病死率高，恶性程度高[1]。目前，新辅助化疗联合手术是早期OS治疗的一线选择方案，术前化疗可杀死部分OS细胞和微小的跳跃灶、缩小肿瘤体积，有利于手术切除。但仍有部分患者面临治疗失败，导致早期局部复发或远端转移，其主要原因是肿瘤细胞对抗癌药物耐药及低敏感度[2]。近年来，逆转OS耐药的制剂逐渐应用于临床，但效果不佳且不良反应大，因此寻求全新的有效逆转肿瘤耐药的方法迫在眉睫。中医药具有高效、低毒、多靶点、多通路协同作用的优势，近年来关于中医中药逆转肿瘤多药耐药的研究较多，ABC跨膜转运蛋白系统参与了肿瘤细胞多药耐药的重要进程，已有大量研究证实部分中药可通过调控ABC跨膜转运蛋白系统逆转OS细胞的化疗耐药[3]。本文从ABC跨膜转运系统与OS化疗耐药性产生的关系及中医药通过调控ABC跨膜转运蛋白系统的机制作一概述，以期为中医药辅助治疗OS提供临床依据。

1 ABC跨膜转运系统

近年来，对于肿瘤化疗耐药的产生机制已取得了大量的突破性进展，发现化疗药物的摄取与转运及活化障碍、转运药物的酶活性异常、肿瘤细胞损伤修复能力增强、细胞周期阻滞与凋亡失衡、自噬等都会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感度[4]，其中化疗药物摄取、转运及活化障碍尤为重要，肿瘤细胞可借某些膜蛋白的跨膜转运功能将化疗药物排出细胞外，从而达到降低细胞内有效药物浓度的目的，进而降低化疗药物的杀伤作用。ABC（ATP-binding cassette,ABC）跨膜转运蛋白超家族在肿瘤细胞中的主要作用是将那些进入细胞内的化疗药物转运出去，它参与了肿瘤细胞多药耐药的重要进程，目前发现该家族有48个成员，研究较多的如P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）、多药耐药相关蛋白1（MDR-associated protein,MRP1），可作为化疗药外泵系统，降低肿瘤细胞内药物浓度，最终对多种化疗药物产生耐药[5]。

1.1 P-gp介导的肿瘤化疗耐药机制

P-gp是有MDR编码的分子量为170 kDa的蛋白质，约包含1276～1280个氨基酸，依赖ATP产生的能量发挥其功能[6]。P-gp与转运毒物及药物等的解毒功能有关，位于细胞膜上，由结构相似的两半组成，每一半都有1个跨膜结构域（MSD）和1个高度保守的ATP结合域（NBD）[7]。P-gp与多种肿瘤细胞的多药耐药性的产生有关，肿瘤细胞膜表面高表达的P-gp能抑制抗肿瘤药物的吸收并促其外排（如蒽环类、紫杉醇、长春碱、依托泊苷），导致肿瘤细胞对抗肿瘤药的低敏感度。综合现有研究，P-gp参与化疗耐药途径的机制有三种：（1）药物与P-gp直接结合并排除胞外；（2）抗肿瘤药与P-gp在脂质分子层结合，从而化疗药未进入胞内便被排出；（3）部分抗肿瘤药最终进入肿瘤细胞内，P-gp会将其泵入细胞质内膜腔，出胞作用将其排出细胞[8]。此外，P-gp还可通过各种方式参与肿瘤细胞的凋亡、增殖、迁移及促进肿瘤细胞上皮间质转化等。目前已有大量研究证实P-gp的高表达与肿瘤恶性程度及化疗耐药性的产生密切相关，Sugawara[9]报道，在肾上腺肿瘤、胰岛素肿瘤、肺癌、胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、膀胱癌组织中P-gp均存在高表达，与肿瘤的恶性组织学行为呈正相关。Leonard等[10]发现在结肠癌、肾癌、白血病和乳腺癌等恶性肿瘤化疗后肿瘤的进展与P-gp的表达也呈正相关。杨力[11]研究发现P-gp在OS组织中多呈阳性表达，可作为判断OS性质及评估其化疗预后的指标。由此可见，多种肿瘤组织内存在P-gp的异常表达，且与肿瘤组织的恶性程度及对化疗药物的敏感度密切相关。

1.2 MRP1介导的肿瘤化疗耐药机制

MRP1基因位于人类染色体16p13.1上，与P-gp的功能相似，都可通过外排作用泵出抗癌药物发挥肿瘤细胞的解毒作用，但二者转运底物和机制存在差异，MRP1优先运载亲水分子和有机阴离子，无法转运未被修饰的抗肿瘤化合物，在泵出化疗药物前抗癌药物需要与谷胱甘肽（glutathione,GSH）、谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione S-transferase,GST）耦合为有机阴离子结合物，然后再依靠细胞膜上的ATP泵出细胞外，从而降低化疗药在细胞内的有效作用浓度[12]。同时，MRP1可改变细胞内药物的分布，阻断细胞的解毒系统，从而介导耐药[13]。现有的研究发现MRP1蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，且与患者的预后相关，介导着如OS、肝癌等多种恶性肿瘤的耐药过程[14]。Li等[15]研究了缺氧与人OS细胞Notch信号通路和MRP1的表达关系，发现低氧条件下OS细胞可通过Notch信号途径上调MRP1蛋白的表达，从而导致对化疗药物的敏感度降低。总之，MRP1的表达与OS密切相关，与OS恶性程度、耐药程度呈正相关。

2 中药逆转骨肉瘤化疗耐药的研究

2.1 通过调控P-gp的表达逆转OS化疗耐药

中药逆转OS化疗耐药常见的机制是通过钙离子阻滞作用及调控某些信号通路的表达，从而抑制P-gp的表达起到逆转化疗耐药的作用。中药粉防己主要活性成分粉防己碱具有抗炎、钙通道阻滞及抗氧化的作用[16]，高浓度粉防己碱具有强大的逆转阿霉素对OS耐药的作用，可通过抑制细胞膜上P-gp的表达增加化疗药在人OS耐药U2OS细胞内的积聚，抑制外排[17]。姜黄素与粉防己碱相似，亦可通过抑制P-gp的表达增加化疗药在耐药细胞内的有效作用浓度，体外研究发现，2 μg/ml的姜黄素对U-2OS/ADM细胞的抑制率接近50%[18]。我国著名传统方剂片仔癀的抗肿瘤作用已得到广泛证实，可通过诱导OS细胞凋亡、抑制其迁移和侵袭能力，有效地在体内外水平抑制OS细胞生长[19]。同时，体外研究发现[20]片仔癀具有显著逆转OS细胞耐药的作用，与姜黄素、粉防己碱相比，片仔癀似乎更具优势，其不仅可通过抑制P-gp的表达，增加化疗药在耐药细胞U-2OS/ADM内的有效积聚，还可通过调控凋亡蛋白家族（下调抑凋亡蛋白Bcl-2，并上调促凋亡蛋白Bax的表达）显著增加耐药OS细胞U-2OS/ADM的凋亡作用，因此片仔癀可通过多途径有效逆转OS细胞的耐药作用。芦荟酮B是中药苦豆子的黄酮类化合物，具有黄酮类化合物典型的抗炎、抗氧化作用。Xia等[21]通过体外研究发现芦荟酮B可以通过NF-κB信号途径抑制P-gp的转录和表达有效逆转MG-63/DOX细胞对多柔比星的耐药性，同时，研究还发现无毒浓度下的芦荟酮B可以增加多柔比星诱导的OS细胞凋亡。研究发现中药砒霜主要活性成分三氧化二砷[22]与川芎嗪[23-24]均可通过下调细胞膜P-gp和Bcl-2蛋白增强OS细胞的化疗敏感度，诱导其凋亡，川芎嗪可以显著增强U-2OS细胞对阿霉素、甲氨蝶呤、异环磷酰胺的敏感度，三氧化二砷联合阿霉素能显著抑制MG63/DOX细胞的增殖。综上，我们发现，许多中药单体具有明确的逆转OS化疗耐药的作用，最主要的机制是抑制细胞膜表面的P-gp表达，部分中药单体还与细胞内信号通路、抑凋亡蛋白Bcl-2及促凋亡蛋白Bax的协同调控有关。

2.2 通过调控MRP1的表达逆转OS化疗耐药

MRP1蛋白介导着多种肿瘤细胞对化疗药物，如抵抗蒽环类、长春新碱、抗叶酸药物等[25]的耐药过程，与OS的耐药机制密切相关，已有部分研究证明中药有效成分可通过下调MRP1的表达逆转OS化疗的耐药性。淫羊藿有效成分淫羊藿苷Ⅱ和淫羊藿苷（ICT）对人OS耐药细胞MG-63/DOX均有逆转多药耐药的作用，且ICT逆转作用更佳，呈剂量依赖性诱导凋亡，机制研究发现ICT降低了MG-63/DOX细胞内MDR1和MRP1基因编码的蛋白水平[26]。β-榄香烯不仅可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长，减少骨肉瘤患者化疗不良反应，还可以协同增强放化疗的效果[27-28]。体外研究发现榄香烯能通过下调MRP1的表达有效抑制阿霉素所诱导的MG-63细胞耐药[29]。此外，P-gp/MRP1抑制剂汉防己甲素能够有效逆转OS细胞对阿霉素、依托泊苷、长春瑞滨的耐药性，因而对已产生耐药的OS治疗推荐P-gp和MRP1抑制剂联合应用[30]。综上，中药有效成分在逆转OS化疗耐药的过程中与下调MRP1的表达密切相关。另外，屠重棋等[31]应用免疫组织化学法检测了6例正常骨组织和45例OS组织中MRP1的表达，发现MRP1在OS中高表达，且与恶性程度呈正相关。因此，抑制MRP1的表达是降低OS侵袭性与逆转化疗耐药的有效手段。

3 小结

近年来，中药抗肿瘤研究呈日渐增多的趋势，中药可利用多通路、多靶点协同的优势，不仅能提高机体免疫功能，还具有明显的化疗增敏、改善肝功能、促进造血功能恢复、防止肺转移等辅助抗肿瘤的作用[32]，因此在OS治疗过程中具有较好的应用价值和前景。目前中药逆转肿瘤化疗耐药的主要机制有下调P-gp的表达、抑制MRP1基因的表达、促进耐药细胞的凋亡、调控某些信号通路等[33]，其中P-gp与MRP1是ABC跨膜转运系统的主要成员蛋白，也是目前介导OS化疗耐药的主要分子蛋白，通过上述研究发现大多数中药是通过下调P-gp与MRP1实现OS逆转耐药的，但部分中药单体如榄香烯可通过多种途径（降低MRP1表达及抑制酶系统表达）逆转OS的化疗耐药，且目前的研究主要集中在体外实验，因此在未来应注重单体的临床疗效对比研究及部分明确有逆转作用的中药单体其他机制的再研究，以发挥中药抗OS的最大优势。