肝内胆管癌治疗靶点的研究进展

林间，王海波，沈锋

0 引言

肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC）通常被认为起源于肝内胆管上皮细胞，其发病率在全世界范围内呈明显上升趋势[1]。ICC发病隐匿，侵袭性高，易侵犯肝脏周围组织，发生淋巴结和远处转移，因此大部分患者在初诊时已处于晚期。即使在有条件接受根治性手术的患者中，术后复发率仍有40%～80%，5年生存率仅为20%～40%[2]。ICC目前缺乏有效的治疗方案。近年来，随着对ICC分子水平及肿瘤微环境的深入研究，发现许多潜在的治疗靶点。本文就ICC新发现的治疗靶点进行综述。

1 ICC肿瘤微环境相关的潜在治疗靶点

肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）是由肿瘤细胞及其周围基质细胞、免疫细胞、脉管系统及分子信号等形成的复杂网络，是肿瘤发生、发展、维持的一个关键因素。ICC的肿瘤微环境以致密的纤维炎性间质为特征，称为肿瘤反应性间质（tumor reactive stroma,TRS）。这种独特的微环境被肿瘤细胞激活后，释放大量的旁分泌信号，在促进ICC侵袭性生长、转移、对化疗和靶向药物以及免疫抑制剂的治疗抵抗等方面发挥关键的作用[3]。

肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）作为TRS的关键成分，促进了肿瘤的增殖、侵袭、转移和化疗抵抗等恶性行为。对ICC患者的癌及癌旁标本进行单细胞测序后发现，大量的CAFs高表达IL6，诱导ICC细胞发生明显的表观遗传学改变，增加其恶性程度[4]。全外显子测序发现成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）编码基因是ICC最常见的基因突变之一。在一项针对吉西他滨治疗无效的ICC患者的多中心Ⅱ期临床试验中，FGFR酪氨酸激酶抑制剂BGJ398达到了14.8%的有效率以及75.4%的疾病控制率，展示了该靶点强有力的治疗前景[5]。抗纤维化药物尼达尼布（nintedanib）是一种酪氨酸激酶的小分子抑制剂，可作用于FGFR、血管内皮细胞生长因子受体和血小板衍生生长因子受体，明显抑制化学诱导的肝纤维化[6]。尼达尼布在ICC细胞系中可以减少活化的CAFs表达IL6、IL8等促癌因子，抑制ICC细胞的增殖和侵袭。体外试验中，尼达尼布抑制了移植瘤的生长，并可增强ICC化疗药物吉西他滨的疗效，提示联用尼达尼布和传统细胞毒药物有望治疗伴有CAFs激活的难治性ICC[7]。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAMs）是组成TRS的另一重要成分，主要通过极化的M2表型促进肿瘤细胞的增殖、血管生成和转移[8]。在ICC患者中，高密度M2极化的肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAMs）与高侵袭性和不良的预后显著相关。M2-TAMs可通过促进分泌细胞因子（如粒细胞——巨噬细胞集落-刺激因子、肿瘤坏死因子-α和IL6等）、趋化因子（如CCL1、CCL2等）来诱导肿瘤微环境[9]。CD11b和MHC-Ⅱ均阳性的TAMs可以通过与抗体的Fc结构域结合，去除结合在PD-1阳性T细胞上的抗PD-1抗体，从而消除这种免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用[10]。在肿瘤形成的背景下，上皮-间充质转化（epithelialmesenchymal transition,EMT）使肿瘤细胞增加了发生和转移的潜能，抵抗免疫系统对肿瘤的清除[11]。体外试验中，M2-TAMs可以促进ICC细胞的EMT，增强了细胞的侵袭和转移能力。集落刺激因子1（colony stimulating factor 1,CSF1）/CSF1受体轴是影响TAMs分化的关键因素。因此，TAMs是一个潜在的ICC治疗靶点，针对该靶点可能可以增强免疫检查点抑制剂及细胞毒药物疗效。

2 肿瘤基因相关的潜在治疗靶点

2.1 非编码RNA

非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）是一系列不参与蛋白质编码的RNA的总称，包括微小RNA（microRNA,miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）等，通过招募调控相应基因表达的启动子等特定的蛋白质复合物到基因组DNA上，在调节肿瘤细胞的发生、增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡等方面发挥重要作用。MiRNAs编码基因的突变和miRNAs的异常表达和包括ICC在内的多种肿瘤相关。Wu等[12]报道，miR-424-5p在ICC组织中下调，其过表达可显著抑制ICC细胞的侵袭和迁移。ARK5是人AMP活化蛋白激酶（AMPK）家族的新成员，已发现其通过调节EMT促进肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）细胞系的侵袭、转移，并诱导肿瘤对阿霉素耐药。该研究亦发现，ARK5高表达和ICC患者预后不良相关，敲除ARK5基因后可抑制ICC细胞的侵袭和迁移。而miR-424-5p通过与ARK5 mRNA的3’-UTR结合，抑制mTOR磷酸化，从而抑制ARK5的表达，下调EMT。靶向miR-424-5p及ARK5可以抑制ICC细胞的侵袭、迁移和EMT进展，可能成为ICC治疗的一种有效措施。

Rab1A是RAS癌基因家族中的一员，其异常激活参与宫颈癌、乳腺癌、前列腺癌、HCC等多种肿瘤的发生、发展[13]。最近一项国内的研究发现，在ICC组织中，Rab1A在mRNA水平及蛋白水平过表达，其高表达是ICC患者预后不良的关键因素之一[14]。MiR-212-3通过抑制细胞周期及EMT，靶向调控Rab1A，导致ICC细胞增殖和迁移受抑制，提示Rab1A作为靶点在ICC治疗中的潜在价值。

葡萄糖是肿瘤细胞最主要的能量来源，在很多肿瘤中都观察到葡萄糖转运蛋白（glucose transportertype 1,GLUT1）的过表达[15]。据报道，GLUT1在ICC组织中高表达，其过表达和较短的总生存期、无瘤生存期相关。GLUT1正向调控和肿瘤转移密切相关的基质金属蛋白酶2，GLUT1相关基因被敲除后，ICC细胞增殖、运动、侵袭能力降低，且对吉西他滨的敏感度显著提高，而miR-148A直接调控GLUT1，其水平下调导致ICC中GLUT1过表达，导致肿瘤进展和吉西他滨耐药[16]。该靶点的发现可能有助于解决ICC患者在接受吉西他滨治疗过程中常发生获得性耐药这一问题。

具有植物同源域和环指结构域的泛素样蛋白1（ubiquitin-like with plant homeodomain and ring finger domains 1,UHRF1）是DNA甲基化维持的关键调节因子，与肿瘤发生、发展和侵袭、凋亡有关，目前已经在多种肿瘤中观察到其过表达[17]。Zhu等[18]报道，UHRF1在ICC组织中过表达，和预后不良有关。下调的UHRF1减弱了G1/S细胞周期的转变，进而抑制了体外细胞增殖和体内肿瘤生长。在对其上游机制的探寻中，发现miR-124-3p直接调控UHRF1，该miRNA的升高导致UHRF1的表达降低，从而抑制了ICC细胞增殖、细胞周期阻滞[18]。

除了上述miRNA，还有多种miRNA被证实在ICC中异常表达。MiR-129-2-3p在ICC中表达显著降低，而miR-19b-3p则升高，二者均与肿瘤远处转移和临床分期明显相关。外源性增强miR-129-2-3p表达及miR-19b-3p的抑制剂都明显抑制ICC细胞的增殖和侵袭能力[19-20]。

LncRNA也在一些研究中被证实在ICC进展过程中起到关键作用。CDKN2B-AS1、CASC15在ICC中均异常表达[21-22]，参与多种肿瘤生物学过程的调节。HAGLROS在ICC中高表达，与不良预后相关。HAGLROS通过mTOR信号通路调节ICC脂质代谢。在ICC细胞系中敲除HAGLROS后脂质相关蛋白水平降低，细胞进程受阻，mTOR轴失活，自噬增加[23]，而ZEB1-AS1、PCAT6的高表达与ICC患者的临床进展及不良预后相关。ZEB1-AS1通过miR-200A/ZEB1信号通路诱导EMT，而PCAT6通过调控miR-330-5p促进ICC细胞系的增殖、转移，异位表达miR-330-5p可抑制细胞增殖和侵袭[24-25]。

综上所述，各种非编码RNA通过不同的调控机制影响了ICC的侵袭行为，有望成为新的预后标志物及重要的治疗靶点。

2.2 癌基因

染色质解旋酶DNA结合蛋白1样基因（chromodomain helicase/ATPase DNA binding protein 1-like,CHD1L）被认为是一种癌基因，可影响肿瘤细胞多药耐药、DNA修复、抗凋亡，其过表达与多种恶性肿瘤的不良预后相关[26]。CHD1L的多种致癌机制使它成为了多个肿瘤的潜在治疗靶点。一项国内研究通过分析ICC患者的肿瘤组织及配对的非肿瘤标本，发现CHD1L在ICC中表达上调，与肿瘤组织分化程度、血管浸润、淋巴结转移和TNM分期显著相关。CHD1L表达阳性的ICC患者预后差于表达阴性的患者。在体内和体外试验中，CHD1L和肿瘤细胞侵袭能力相关。CHD1L被RNAi沉默后，ICC细胞的侵袭和转移能力受到了抑制[27]。

Y染色体性别决定区（sex-determining region of Y chromosome,SRY）-盒转录因子9（SRY-box transcription factor 9,SOX9）作为癌基因参与肿瘤的启动、增殖、迁移、化疗耐药和细胞干性维持。在一项对59例ICC患者的研究中，发现高SOX9表达的ICC患者生存时间明显短于低表达的患者。用siRNA干扰SOX9可显著降低与药物代谢和多药耐药相关的基因/蛋白的表达，增加了与p53信号通路相关基因的丰度[28]。检查点激酶1是一种关键的细胞周期检查点蛋白，协调DNA损伤反应，并抑制多药耐药基因的表达。敲除SOX9基因后，吉西他滨诱导检查点激酶1的磷酸化受抑制，导致ICC细胞凋亡明显增加。提示在ICC患者中，可通过靶向SOX9基因调控吉西他滨的效果[28]。

3 肿瘤表达蛋白和表观遗传修饰酶相关的潜在治疗靶点

3.1 靶点蛋白

哺乳动物转录因子Forkhead Box M1（FOXM1）是Forkhead蛋白质家族的成员。既往研究发现，FOXM1逃避抑癌基因p53的肿瘤抑制作用、增加肿瘤细胞对凋亡及基因组不稳定性的抵抗[29]。Liu及同事[30]分析了184例ICC患者的组织标本中FOXM1表达及其与临床病理特征和预后的关系，发现FOXM1过表达与肿瘤多发结节、肿瘤＞5 cm、淋巴结转移、TNM分期、不良预后有关，上调FOXM1显著促进ICC细胞的增殖、迁移和侵袭。基因富集分析发现FOXM1影响ICC增殖、侵袭、转移和凋亡相关的c-Myc、P53、经典WNT、c-MET和ATM等通路，表明FOXM1在ICC的不同发展阶段均扮演了重要的角色。Forkhead蛋白质家族FOXA亚家族中，FOXA1和FOXA2作为雌激素和雄激素信号转导的关键因子，与HCC的发病关系密切。在ICC中，低表达的FOXA1和高表达的FOXA3与ICC细胞的侵袭能力、肿瘤的恶性行为及不良预后相关[31]。总之，Forkhead蛋白质家族的部分成员是ICC患者的可靠预后指标之一，有望成为该病的治疗靶点。

3.2 表观遗传修饰酶

甲基化、磷酸化、乙酰化等修饰在细胞的信号转导、代谢、发育等生命过程中发挥着重要作用。DNA甲基化的动态模式和肝癌的生物学行为、临床结局、化疗药物耐药性密切相关。随着对癌症基因组研究的不断深入，编码H3K4特异性去甲基化酶KDM5C的基因被鉴定为肿瘤驱动基因，具有抑癌作用。在ICC中，发现其在肿瘤组织中表达下调，低表达和预后不良相关。过表达KDM5C抑制细胞增殖、侵袭和脂肪酸代谢等关键信号通路，故该基因是一种ICC恶性行为相关的靶基因[32]。大麻素受体相互作用蛋白1（cannabinoid receptor-interacting protein 1,CNRIP1）已被证实和乳腺癌、食管癌的预后相关。新发现CNRIP1通过抑制丙酮酸激酶M2的活性来抑制肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖，其持续过表达抑制了小鼠异种移植瘤的生长。临床上，CNRIP1与ICC患者的病理分级、TNM分期等相关。提示CNRIP1可作为预测ICC患者肿瘤复发的候选生物标志物，强调了以CNRIP1/Parkin/PKM2通路为靶点治疗ICC的潜在可行性[33]。

安罗替尼（Anlotinib）是一种新型的多靶点酪氨酸激酶抑制剂，已发现在多种实体瘤中具有良好的抗肿瘤作用。最近发现，安罗替尼具有显著抑制肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及阻滞细胞周期的作用。在患者来源的人源肿瘤异种移植模型中，安罗替尼阻碍了裸鼠体内肿瘤的生长。通过转录组及蛋白修饰分析，发现安罗替尼靶向血管表皮生长因子2，通过抑制其磷酸化水平，进而使PIK3/AKT信号通路失活，具有良好的抗ICC活性[34]。阻止AKT信号激活被认为是提高索拉非尼和兰瓦替尼等酪氨酸激酶抑制剂疗效的一个策略。该研究结果可推动安罗替尼作为索拉非尼等药物增效剂的临床试验。

EphA2是一个跨膜酪氨酸激酶受体，其相关基因在ICC中具有较高的突变频率，并与ICC患者的淋巴结转移密切相关。在体外试验和患者来源的异种移植中，其靶点Ser897的磷酸化抑制剂可有效阻碍具有EphA2突变的ICC的转移。提示对于同时具有淋巴结转移及EphA2相关基因突变的患者，Ser897的磷酸化抑制剂可能具有一定的治疗效果[35]。EphA2激活可分为配体依赖性途径和非配体依赖性途径。配体非依赖性途径被认为是致癌途径，激活与表皮生长因子受体靶向药物的耐药机制密切相关，可被其主要配体EPhinA1竞争性抑制。对EphA2等进一步研究可能会提高西妥昔单抗、厄洛替尼等靶向表皮生长因子受体的单克隆抗体的疗效。

3.3 信号通路抑制剂

临床前与临床试验已经发现，PI3K/PTEN/AKT/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、Wnt、IL6/JAK/STAT等信号通路抑制剂在ICC细胞系、异种移植模型及患者中分别起到了不同程度的作用。Notch信号通路是ICC发生的主要驱动力，其受体、配体和下游信号分子等均包含了潜在的治疗靶点。近期一项国外研究发现，选择性的NOTCH1抑制剂Crenigacestat显著减少了五种ICC细胞系中的Notch通路成分，但不抑制其他Notch受体，并对Notch依赖性血管生成具有抑制作用。在研究者团队建立的ICC患者来源的异种移植模型中，Crenigacestat和吉西他滨具有相似的抑制肿瘤生长的效果，表明其作为一种ICC治疗的潜在策略[36]。目前，针对Notch受体和配体的单克隆抗体、反义或RNA干扰和糖基化/蛋白酶抑制剂的研究不断进行，未来有望在Notch信号通路的不同水平中寻找到潜在的治疗靶点。

4 其他潜在治疗靶点

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染与ICC的发生密切相关。乙型肝炎病毒x蛋白（HBV x protein,HBx）作为反式激活蛋白与核转录因子结合，刺激细胞内信号通路，促进肿瘤细胞生长。HBV感染诱导肝祖细胞激活，伴随HBx激活引起的基因异常改变时，将导致恶性转化[37]。笔者单位近年来已对3243例ICC患者行手术治疗，在对其中合并HBV感染的患者进行的一项研究中发现，接受抗病毒治疗的患者预后好于未接受抗病毒治疗且病毒水平较高的患者，肝切除术后病毒重新激活与较差的预后相关。这项大型临床研究的结果揭示HBV感染相关通路及靶点作为ICC预后预测因子以及治疗靶点的潜力[37]。

5 总结

综上所述，目前许多潜在的ICC辅助治疗相关药物仍处于临床前或临床研究阶段，并取得了一些有希望的进展。随着近年来对ICC相关肿瘤微环境、基因、蛋白、表观遗传修饰、信号通路及其与HBV关系的研究不断深入，潜在治疗靶点不断被发掘，基于这些靶点的临床试验将会层出不穷，为这种高度恶性、预后不佳的肿瘤的治疗带来新曙光。