AMPK在组织工程骨促骨再生研究中的应用及进展

张玉敏 葛林虎 曾素娟

广州医科大学附属口腔医院儿童口腔科， 广州市口腔再生医学基础与应用研究重点实验室，广东 广州 510182

骨质疏松、肿瘤、外伤及骨髓炎等均可造成患者骨缺损、骨骼畸形及功能障碍，进而影响生活质量。鉴于传统骨移植修复方式带来的免疫排斥及供体不足等诸多缺点，组织工程骨(tissue engineered bone，TEB)促骨再生联合MSCs诱导成骨可克服上述缺点，在骨缺损修复和再生领域具有广阔前景。AMPK是一种细胞能量稳态介质，调节细胞能量代谢及机体能量储存与消耗。体内外研究显示AMPK的活化可显著促进新骨形成，过表达AMPKα1及α2均使小鼠体内异位骨形成增加[1]，这表明AMPK还参与了骨组织生理活动的调控。本文将综述AMPK在TEB促骨再生中的最新研究进展，以期为骨缺损修复及骨再生提供新思路。

1 AMPK结构和激活

AMPK是由催化性α亚基及调节性β和γ亚基构成的异源三聚体。大多数真核生物的基因组中都编码其中一种亚型的基因，而哺乳动物可编码多种亚型(α1、α2、β1、β2、γ1、γ2、γ3)的基因。组织间AMPK亚型的表达水平不同，衍生出多种亚型组合。近期研究显示小分子配体对AMPK亚型激活可能因其亚型组成的不同而存在显著差异，这为研发AMPK同工型选择性激活剂提供新思路[2]。

哺乳动物体内激活AMPK常通过3种机制结合5'-AMP来实现：①上游激酶促进α亚基中Thr172磷酸化；②蛋白磷酸酶抑制Thr172去磷酸化；③变构激活。腺苷酸激酶反应(2ADP→ATP+AMP)在大部分细胞中接近平衡，而AMP对Thr172去磷酸化作用比ADP更强，因此，AMPK的活性主要受细胞中AMP/ATP比率的调节，AMP/ATP 比率升高，则AMPK被激活[3]。除了AMP水平的调控外，其他非典型途径也可调控AMPK。肝激酶B1(LKB1)、钙/钙调素依耐性蛋白激酶(CaMKK)和转化生长因子β活化激酶1(TAK1)等上游激酶可完全激活AMPK。另外，介导AMPK泛素化降解的诱导细胞凋亡DNA片段化因子45样效应因子a(CIDEa)及Ras激酶抑制剂2(KSR2)也可调控AMPK[4]。近期研究发现脂肪酸、白藜芦醇和小檗碱等天然营养物质对AMPK具有正调控作用，可能成为活化AMPK的药物[5]。最近Zhang等[6]发现胞外葡萄糖和胞内果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)的降低也能激活AMPK，而急性葡萄糖饥饿通过减少FBP与醛缩酶溶酶体上的轴蛋白结合来激活AMPK/LKB1通路，从而导致AMPK的激活不依赖于AMP而改变。

2 AMPK在TEB促骨再生中的研究

2.1 AMPK对MSCs成骨分化的调控

骨形成的两种成骨方式软骨内成骨和膜内成骨均始于MSCs。研究表明AMPK可调控MSCs成骨分化，并能调节成骨和成脂分化的平衡。Chen等[7]证实AMPK激活剂二甲双胍和A769662 通过调控Runt相关转录因子2(Runx2)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的活性来抑制C3H10T1/2 MSCs成脂分化和促进其成骨分化。Wang等[8]发现二甲双胍可激活AMPK/LKB1信号通路，从而促进多能干细胞来源MSCs(iPSC-MSCs)形成更多的矿化结节，且可显著上调碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、Runx2和Osterix(Osx)等成骨相关因子的表达。Kim等[9]使用Compound C或shRNA 沉默MSCs的AMPKα1基因后，AMPKα1蛋白水平均降低，脂肪生成增多，矿化基质却明显减少，表明AMPK的沉默可负向调节MSCs成骨分化而正调节脂肪分化。上述研究表明AMPK可能是MSCs分化的关键调控因子，激活AMPK能够增强MSCs的成骨潜能，正向调节骨内环境的稳定。

2.2 AMPK对成骨细胞的作用

成骨细胞起源于MSCs，负责骨的形成和骨质量的维持。AMPK通过调节成骨细胞的增殖、分化和矿化促进骨再生，然而控制成骨细胞分化的机制尚未完全阐明。Runx2、骨钙素(osteocalcin，OCN)、Osx及骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)等是成骨细胞分化的转录因子和诱导因子，AMPK通过增强它们的表达来促进成骨细胞分化和矿化。近期研究表明，AMPK活性是BMP2诱导成骨细胞矿化所必需的，其参与了BMP 2诱导的Runx2表达，而与Osx表达无关，抑制AMPK后可显著降低BMP2的骨诱导作用，并证明AMPK不参与BMP-2诱导的细胞内Smad磷酸化，这表明AMPK可能在Smad下游或非Smad通路中对成骨细胞分化发挥作用[10]。Zhang等[11]发现成骨细胞分化通过激活AMPK引起BMP2及其下游Smad1磷酸化，而此发现和部分研究结果[10]并不一致。显然AMPK/BMP2对成骨细胞的确切作用尚有待探索。Chava1等[12]发现Runx2是AMPK的新型调节底物，活化的AMPK和RUNX2-S118磷酸化与成骨作用密切相关，并证明AMPK可能维持骨细胞与脂肪细胞的稳态，低水平AMPK有利于脂肪生成，而高水平AMPK通过稳定Runx2蛋白而促使骨细胞的形成。另外，活化的AMPK通过增强Runx2和小异源二聚体伴侣的表达促进成骨细胞分化和矿化，同时通过增加成骨细胞的骨保护素(osteoprotegerin，OPG)和降低NF-κB受体活化因子配体(RANKL)的表达，从而发挥潜在的抗破骨作用[13]。

2.3 AMPK对破骨细胞的作用

破骨细胞是多核、终末分化的骨吸收细胞，骨组织通过破骨细胞吸收旧骨和成骨细胞形成新骨来不断更新和重建。OPG/NF-κB 受体活化因子(RANK)/RANKL系统是调控破骨细胞形成的主要信号轴。破骨细胞存活受细胞内外ATP相互变化的调节，AMPK作为细胞内能量稳态可调控破骨细胞的分化和功能[14]。先前研究表明AMPK的活化显著降低RANKL的表达，可作为RANKL诱导破骨细胞生成的负反馈调节因子，提示激活AMPK直接抑制破骨细胞的生成，并通过调节成骨细胞中的OPG/RANKL信号间接抑制破骨细胞的分化[15]。另有研究表明AMPK对破骨细胞的抑制作用与其抑制破骨细胞分化和骨吸收相关的因子有关，包括活化T细胞核因子c1(NFATc1)、c-Fos、脾酪氨酸激酶(Syk)、组织蛋白酶K(CTSK)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)[14]。最近，Tong等[16]发现抑制AMPK后使雷帕霉素(mTOR)和下游靶标p70S6K磷酸化增加，减少细胞自噬，逆转OPG对破骨细胞分化的抑制作用。由此可见，AMPK在破骨细胞分化和骨吸收中的作用仍存在争议。

2.4 AMPK对血管再生的作用

骨的形成和再生过程关键取决于生长板区域血管的形成，这是由成骨细胞分泌的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与内皮细胞间相互作用引起的，然而确切的机制仍有待阐明。体内外研究表明人脐带MSCs来源的外泌体通过增加VEGF和低氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达，刺激内皮细胞增殖和迁移，促进血管新生，进而促进骨折愈合[17]。AMPK不仅对内皮细胞具有保护作用，还能刺激内皮祖细胞的分化，发挥更好的促血管效应。研究表明二甲双胍可改善小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成血管能力和迁移能力，加速糖尿病小鼠骨创面愈合及血管生成，并且通过激活AMPK增加一氧化氮的释放来改善内皮祖细胞的血管生成功能，从而保护血管免受损伤[18]。Qu等[19]发现激活AMPK通路后可上调小鼠MC3T3-E1细胞中ALP、Runx2、OCN和VEGF的mRNA水平，进而促进成骨分化及血管生成。综上可知，AMPK可通过调节血管生成促进骨再生。

3 AMPK在TEB促骨再生中的作用机制

3.1 AMPK通过抑制活性氧产生来促进骨再生

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是生物反应产生能量的副产物，主要通过氧化代谢途径产生于线粒体内。低水平ROS参与细胞内稳态、细胞增殖、特异性分化和自我更新等生物功能。激活AMPK通过抑制ROS的产生，恢复糖尿病小鼠成骨细胞的功能及促进骨再生[20]。AMPKα1的上调抑制了ROS的产生，增强人脂肪组织来源的MSCs成骨分化[21]。最近Zhou等[22]发现白藜芦醇通过激活AMPK通路下调内源性ROS生成，进而促进衰老BMSCs的成骨分化。

ROS增多引起的氧化应激反应会影响成骨细胞的存活、增殖及分化，且与骨质疏松症等许多代谢性疾病的发生有关。AMPK在不同细胞类型中应对氧化应激时起保护作用[23]。Fan等[24]发现AMPK活化后可激活核因子E2相关因子2(Nrf2)和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)信号，从而抑制地塞米松诱导的氧化应激保护成骨细胞免受损伤。近期研究发现氧化应激通过抑制AMPK通路来抑制BMSCs成骨分化，反之，运用褪黑素激活AMPK/FOXO3a/RUNX2通路后使BMSCs恢复体外成骨分化潜能[25]。综上所述，激活AMPK可抑制ROS产生及保护细胞免受氧化应激损伤，从而促进骨再生。

3.2 AMPK通过促使细胞自噬来促进骨再生

自噬是MSCs分化过程中细胞体积降解的主要途径，与成骨和骨骼发育有关，细胞自噬减少可导致小鼠骨量下降[26]。AMPK和mTOR靶标对自噬至关重要，AMPK通过抑制mTOR活性来激活自噬。Vidoni等[27]研究表明白藜芦醇和成骨诱导因子地塞米松、β-甘油磷酸酯和抗坏血酸协同激活AMPK/BECLIN-1通路调节细胞自噬，促进人牙龈MSCs的成骨分化。Bai等[28]发现活化的AMPK可抑制p-mTOR活性，激活BMSCs自噬来促进肥大细胞及软骨细胞的分化，进而促进软骨内成骨修复。下调AMPKα表达抑制自噬，直接减少破骨细胞生存和增殖[29]。体外研究报道通过AMPK/mTOR通路介导BMSCs成骨分化和自噬过程之间的串扰[30]。最近Cheng等[31]发现锶处理MC3T3E1细胞后p-AMPK表达增加，启动细胞自噬，进而诱导下游分子p-mTOR表达降低，促进细胞成骨分化，结果证实AMPK/mTOR信号通路在自噬促进的成骨细胞分化过程中起着关键的调节作用。由此可见，AMPK可有效调节自噬来促进骨平衡及再生。

3.3 AMPK通过激活SIRT1来促进骨再生

沉默信息调节因子1(silent information regulator type 1，SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性去乙酰化酶，可调节MSCs的新陈代谢、生长、分化和抗氧化反应。近年来，体外研究表明直接激活SIRT1可促进MSCs成骨分化，抑制其成脂分化。此外，SIRT1介导的抗氧化作用也有利于MSCs成骨分化[32]。Li等[33]报道SIRT1与细胞内抗氧化酶之间呈正相关，SIRT1促进MSCs成骨分化后抗氧化应激的能力显著增强。

AMPK作为SIRT1主要的上游激酶，早期关于AMPK/SIRT1信号通路的研究主要与2型糖尿病、肥胖等代谢性疾病相关，近年来其在骨形成中的作用也逐渐引起重视。Wang等[34]发现小分子化合物KGN通过激活AMPK/SIRT1通路改善细胞内抗氧化性能，促进BMSCs成骨分化。另有研究证实机械拉伸诱导细胞抗氧化反应，并通过激活AMPK/SIRT1通路促进BMSCs的成骨分化，相反，运用Compound C及乙酰化酶分别抑制AMPK及SIRT1的表达后，细胞抗氧化活性下降，钙化物沉积及成骨基因BGLAP及Runx2水平显著下降，促成骨作用被逆转[35]。因此，AMPK/SIRT1信号通路可能是调控MSCs成骨分化机制之一。

综上所述，骨再生是成骨细胞、破骨细胞及血管等多种因素相互作用下的结果。AMPK在TEB促骨再生中具有重要的调节作用，近年来研究显示AMPK参与骨再生作用机制可能与ROS、细胞自噬及SIRT1等有关，但其确切机制尚不明确。由于目前研究中使用的AMPK激活药物缺乏特异性，且AMPK在不同组织中亚型组合也不同，骨组织中特异性AMPK激活剂尚未发现，使其很难应用于体内试验进而影响研究结果的可靠性。因此，关于AMPK在骨组织中累积整体水平及作用机制仍需深入探究，使其进一步指导临床骨缺损治疗及用药。