自噬在骨质疏松与骨稳态中作用的研究进展

张洪宇 刘方煜 范一鸣 李帅 王岩松

哈尔滨医科大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150000

1 骨代谢与骨质疏松

骨骼系统的发育、生长、维持处于动态平衡状态，对机械刺激及激素波动异常敏感。在生物体内骨组织通过骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal cell，BMSCs)、成骨细胞、骨细胞、破骨细胞协同作用不断地发生重塑过程。BMSCs具有向成骨、脂肪、软骨方向分化能力的多能干细胞群。成骨细胞与破骨细胞分别负责骨组织的形成与吸收，骨细胞在骨重塑过程中起着关键调控作用[1]。骨重塑对于微骨折的修复，以及骨骼适应不同的机械刺激维持钙稳态都非常重要，在这个过程中任何环节出现问题导致骨吸收多于骨形成量都会造成骨质的流失，并且这种情况随着时间推移会进一步发展为骨质疏松症(osteoporosis，OP)。OP是全身性骨退行性疾病，其特征是骨量减少与骨力学性能的显著退化从而导致骨骼脆性增加与骨折的易感性。近年来骨质疏松性骨折的发病率大幅增加，成为许多国家的公共卫生问题。预计到2050年骨质疏松性骨折在全球范围内将到达630万[2]。

2 自噬的概述

自噬是真核生物进化中高度保守的细胞内物质分解代谢物质循环过程[3]，对细胞内非必要的蛋白、细胞器以及大分子物质加以循坏利用[4]。在缺氧、能量物质缺乏及氧化应激时都可诱发细胞自噬。自噬分为三类：分子伴侣自噬、微自噬和巨自噬。分子伴侣自噬是在分子伴侣蛋白的介导与帮助下直接将胞质内货物运送进入溶酶体[5]。在微自噬中，溶酶体膜直接内凹包裹小部分胞质内物质进入其内部[6]。巨自噬(本文以下简称自噬)是3种自噬中被研究最广泛的，其广泛存在于从酵母细胞到脊椎动物的一切真核细胞生物中。自噬体形成是巨自噬区别于其他两种的显著特点[7]。在自噬发生后，一种吞噬体囊泡结构，延长伸展包裹部分细胞质形成双膜小泡称之为自噬体，随之其与溶酶体膜融合将运送的货物运送到溶酶体内并对货物进行降解，然后溶酶体将分解产生的氨基酸脂肪酸等物质分泌到胞质中进行物质与能量的合成[8]，自噬分为起始/成核、伸长、成熟、降解4个过程。在起始阶段首先形成单层膜样吞噬团，吞噬体的形成与成核的发生与两个复杂的复合蛋白相关联：一种由ULK1/2、Atg13和FIP200组成，另一种叫做Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(PIK3)复合物，由蛋白Beclin-1、Vps15、Vps34、Ambra1和UVRAG等组成[9]。以上复合物与其他一些蛋白共同负责招募与延长吞噬团，Beclin-1是PIK3复合物形成的基础，所以通常被用作观察自噬起始标志物[10]。成核之后，吞噬体延长形成自噬体，这个过程由两个泛素样蛋白复合体调控，由Atg3、Atg4、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和Atg16组成。这个系统促进LC3与磷脂-磷脂酰乙醇胺结合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ进入自噬体膜参与其延长伸展与关闭[11]，所以LC3Ⅱ是自噬体形成的关键，正因如此，LC3Ⅱ被看作成自噬形成的标志性分子。自噬成熟是指自噬体包含的内容物与溶酶体融合并使之酸化，自噬最后步骤是内容物降解为氨基酸脂肪酸等进行细胞循环[12]。目前研究报道表明，自噬功能紊乱与许多疾病发生发展有关，包括心脏疾病、神经退行性疾病、癌症、糖尿病骨骼系统疾病。并且近年来，自噬与骨质疏症的关系成为国内外学者研究的热点与重点。

3 自噬与骨稳态

3.1 自噬与BMSCs

骨髓或者骨膜衬里的BMCSs具有向软骨、骨、脂肪细胞分化能力的多能干细胞群。基础水平的自噬是BMSCs经历氧化应激后存活的关键因素[13]。抑制自噬会引起BMSCs活性氧的累积与DNA的损伤，而大量的细胞内氧化应激又会触发自噬的发生以达到保护细胞的作用，自噬对活性氧的拮抗一定程度上起到了对细胞的保护作用[14]。同时自噬与间充质干细胞的干性维持有很大关系，MSCs在干细胞状态积累自噬体并在分化的开始将其传递给溶酶体，提示自噬相关代谢与MSCs分化存在着密切关系[15]。Qi等[16]研究表明，在OVX小鼠模型中BMSCs成骨分化能力明显减弱并伴随着自噬水平的降低。更有意义的是，全身应用雷帕霉素治疗后可以减轻BMSCs成骨分化能力减弱趋势并一定程度上逆转小鼠骨质疏松表型。

3.2 自噬与成骨细胞

适当水平的自噬是维持成骨细胞存活的先决条件，体外研究表明自噬可以抑制氧化应激介导的成骨细胞凋亡[17]。敲除自噬相关基因增加了成骨细胞的氧化应激，ROS对成骨细胞造成的损伤可以通过细胞自噬早期启动得到缓解[18]。此外，自噬对成骨细胞在各种毒性条件刺激下均具有保护作用，高水平的自噬通量降低了暴露于氟化钠环境中的成骨细胞凋亡[19]。自噬对于成骨细胞实行生理功能亦有很大的作用，在矿化过程中自噬液泡中磷灰石晶体的发现是以上观点的最直接证据，自噬通量的抑制阻碍了成骨细胞向外输送矿物质[18]。骨细胞靶向敲除ATG7基因小鼠在发育期与成年期都表现出骨量流失，骨细胞表现出投射减少情况，5月龄基因敲除小鼠骨小梁体积明显较同龄正常小鼠体积小，证明自噬在成骨细胞分化早期所起到的重要作用[20]。自噬也深度参与机体内生物信号介导的成骨分化能力，例如胰岛素样生长因子促进成骨作用是通过AMPK途径上调自噬实现的[21]。

3.3 自噬与骨细胞

当成骨细胞与骨基质结合后并最终分化为骨细胞这个过程中，自噬也非常重要。骨细胞是位于矿化骨基质分隔间隙中的长寿细胞，其形态学归类更接近神经元[22]。首先成骨细胞在细胞形态与成份上经历了一个剧烈的转变成为骨细胞，这需要细胞器的积极循环。其次矿化环境下的血液灌注有限，骨细胞处于低氧、相对较低水平营养物质环境中，容易导致细胞内活性氧累积[23]。因此在营养分配与利用上需要更加精细与高效。综合以上内容，不难捕捉到自噬与骨细胞稳态的维持与生理功能的实施间的千丝万缕联系。而且有研究报道表明LC3 在成年小鼠骨细胞中高表达，这证明了骨细胞维持基础水平的自噬活动[24]。基因特异敲除ATG7小鼠骨细胞中氧化应激水平升高，并且导致骨量降低骨重塑发生改变出现骨组织衰老表型[25]。类骨细胞在低氧与能量不足的情况下可以通过上调自噬水平维持细胞稳态，呈现出与体内骨细胞相似的生理改变。甲状旁腺激素保护骨细胞免于在低剂量糖皮质激素环境中的凋亡与细胞自噬水平提升有关[26]。骨细胞网络是骨骼组织的机械感应系统。骨细胞依靠其表面伸出的树突状突起形成的细胞网络传递、转变外界机械信号。初始纤毛是一种多功能的细胞器，其主要功能之一是机械感应。初始纤毛、自噬活性与许多骨骼疾病有关，最近有人提出他们之间存在着某种联系[27]。初始纤毛较短的细胞自噬活性相对较高，相反当自噬水平降低使纤毛变长与增强。两者之间极有可能存在着负反馈调节机制[28]。

3.4 自噬与破骨细胞

破骨细胞是造血干细胞来源的多核巨细胞，巨噬细胞集落刺激因子与破骨细胞分化因子调控共同调节其形成。单核细胞趋化因子使单核细胞分化为TRAP和CTSK阳性的破骨前体细胞[29]。ATG-7基因敲除的破骨细胞TRAP与CTSK表达增加，提示自噬参与调控破骨细胞前体的形成。Beclin-1蛋白能促进活性氧的积累与NFATc1基因的表达，以非自噬形式参与RANKL诱导破骨细胞形成[30]。自噬亦可参与低氧、微重力介导的破骨细胞形成过程[31]。TRAE3抑制破骨细胞分化也受自噬调控，应用自噬抑制剂可以增加TRAF3的表达从而抑制破骨细胞形成[32]。自噬诱导TRAF3的降解对破骨细胞的成熟有重要意义。靶向基因敲除破骨细胞ATG5能提升OVX小鼠骨量，说明自噬在年龄相关性激素缺乏导致骨量下降中的作用[33]。张倩等[34]研究表明白藜芦醇通过改变自噬水平对破骨细胞分化形成影响。

4 自噬与骨质疏松发生的关系

骨量在个体生长发育的早期开始积累并在成年早期达到峰值，之后男性与女性的骨量都开始不同程度的丢失[35]。骨量流失的基本生物学机制是骨形成-吸收平衡向破骨测倾斜[36]。自噬与多种先天性或者获得性骨疾病有所关联，如自噬基因表达紊乱引起破骨细胞自噬紊乱导致PD[37]，自噬的过度激活与颅缝过早闭合有关[38]。最近一项基于全基因组关联研究数据的路径分析结果表明，自噬相关基因变异与腕骨矿化密度改变相关[39]。衰老是骨质疏松形成的主要原因已经被大多数专家学者所认同[40]，年老骨质疏松的患者骨组织各细胞自噬水平均有所下降[41]，且在破骨细胞与骨细胞这类终末分化细胞中这种现象更为明显。因此衰老过程中自噬活性的下调可能是衰老相关骨质疏松症的直接原因之一。衰老引起的全身炎症水平上调对骨量的维持亦带来许多负面影响，包括抑制成骨细胞矿化与分化。以及破骨细胞活性的异常激活，炎症信号因子尤其TNF-α影响成骨的部分作用是通过影响细胞自噬实现的[42]。绝经后妇女骨质疏松的主要原因是雌激素分泌不足，在OVX大鼠模型中，骨细胞的自噬水平明显降低，且应用自噬激活剂后可以缓解OVX骨质疏松表型[43]。长期低剂量糖皮质激素治疗是继发性骨质疏松的一个主要原因，大量研究表明糖皮质激素通过影响骨组织各细胞成分自噬代谢紊乱引起骨质疏松[33]。综合目前国内外关于自噬与骨质疏松症的研究，在此笔者对两者的关系进行总结如下：衰老、长期糖皮质激素作用、绝经期妇雌激素降低、长期营养物质缺乏都会导致骨组织细胞内氧化应激的增加导致成骨细胞，骨细胞凋亡，骨髓间充质干细胞分化功能降低，与不同程度的破骨细胞功能降低，从而引起骨量降低最后形成骨质疏松。机体维持适当的自噬水平是面对以上因素引起ROS累积的关键保护因素。但是从细胞分子层面上升到宏观组织与机体时，自噬水平的高低与骨质疏松形成的因果关系就显得不是很清晰，一些研究提示提高细胞自噬水平促进破骨作用和骨吸收，自噬与OP呈正相关，因而采取抑制细胞自噬可能成为治疗或预防OP的新方法。然而，亦有一部分研究得出了相反的结论，自噬水平的降低可能导致OP的发生，指出自噬与OP呈负相关。这种矛盾性虽然为科研工作带来一定的困惑与挑战，但是更为研究自噬与骨质疏松的发生发展关系提供新的思路，应用不同研究方法与技术手段去探明二者关系或者寻求一个平衡点，为将来在临床上治愈骨质疏松症提供一个可能性的调节靶点。

综上所述，自噬与骨稳态的维持与骨质疏松的发生存在着必然的联系，靶向调节骨组织细胞自噬水平可以作为一种前瞻性治疗骨质疏松的新方法，或许可显著逆转临床年龄相关性疾病的骨丢失。然而，在不同的细胞微环境中，自噬的准确调控仍需要足够的临床证据。未来的研究应该集中在年龄相关性骨质流失的细胞自噬机制上，以寻求新的靶点达到临床上治愈年龄相关的骨质疏症。