Wnt/β-catenin信号通路在脊柱小关节骨性关节炎中的作用

王嘉琦 江华

广西医科大学第一附属医院脊柱骨病外科，广西 南宁 530021

骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种多因素相互作用导致关节软骨完整性受损，累及软骨下骨和关节边缘骨赘形成的关节疾病。遗传因素和环境因素在OA的疾病进程中扮演着重要角色[1]。近年的研究[2-3]表明，Wnt/β-catenin信号通路可能通过调节关节组织中的软骨细胞、成骨细胞和滑膜细胞的功能，在OA发病机制中发挥着独特作用。

脊柱作为人体的承重支柱，其后部连接上下椎体的小关节是骨性关节炎的高发部位。脊柱小关节成对位于脊柱后部，是连接相邻脊柱功能单位之间的唯一滑膜关节。在解剖结构上，脊柱小关节由相邻椎体上下关节突以及周围的软组织构成关节囊和滑膜，软骨覆盖于关节面，滑液填充于关节腔内；在生物力学上，脊柱小关节独特的解剖结构使其承受脊柱重力，协助脊柱完成前屈和后伸，同时限制脊柱水平方向的旋转。脊柱小关节发生骨性关节炎的原因和膝关节骨性关节炎类似，均与其特殊的结构和功能密切相关。主要表现为软骨的减少、变薄和软骨下骨硬化，软骨细胞肥大、聚集和凋亡增加，骨赘形成，且伴随基质蛋白多糖的减少。同时，患者软骨下骨组织中出现广泛骨形成和血管形成，炎性细胞浸润和破骨细胞活动增强。炎性细胞浸润导致包括生长调节致癌基因α(GROα)、可溶性血管细胞粘附分子1(sICAM-1)、干扰素γ、白介素IL-1β、IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1α和IL-17E等促炎因子增加，以及IL-10和IL-13等抗炎因子增加[4]。脊柱小关节骨性关节炎可能不引起椎间盘的退变，而椎间盘退变可能引起脊柱小关节骨性关节炎，因为椎间盘退变改变了脊柱运动节段的生物力学效应[5]。既往研究[6]证实，通过Wnt/β-catenin信号通路相关途径可诱发脊柱小关节骨性关节炎和椎间盘退变。

1 Wnt/β-catenin通路

Wnt/β-catenin信号通路是一组信号转导途径，由下列成分组成：配体wnt蛋白、胞膜受体七次跨膜卷曲蛋白(Frizzled)受体家族、低密度脂蛋白受体相关蛋白5、6 (LRP5/6)、Dvl蛋白、支架蛋白Axis抑制蛋白1、2(Axin-1、Axin-2)、酪氨酸激酶1(CK1)、GSK-3β激酶、APC蛋白组成的多蛋白复合体、β-catenin和下游的双向转录因子TCF/ LEF等[7-8]。

典型Wnt/β-catenin信号通路是由wnt蛋白触发的细胞内信号通路，通过胞膜受体和多蛋白复合体调节β-catenin在细胞内的浓度以及分布情况，从而影响细胞核内转录因子，以实现调控下游基因的转录与表达。在wnt蛋白处于静止状态时，β-catenin在细胞内的含量维持在稳定水平，过量的β-catenin被26 S蛋白酶泛素化且被降解。由Dvl蛋白、支架蛋白Axis抑制蛋白1、2(Axin-1、Axin-2)、酪氨酸激酶1(CK1)、GSK-3β激酶以及APC蛋白组成的破坏复合体介导了这一过程。破坏复合体磷酸化β-catenin上特定的氨基酸残基，从而启动β-catenin的降解过程，而β-catenin基因外显子3负责编码这一特定的氨基酸残基。因此，抑制β-catenin的磷酸化或沉默β-catenin基因外显子3即能阻止β-catenin的降解过程。当wnt结合到作为配体的卷曲蛋白和LRP5/6后，卷曲蛋白和LRP5/6的胞内部分与Dvl蛋白、Axin-1/Axin-2以及APC蛋白发生相互作用，使β-catenin从破坏复合体中释放出来，从而使胞内和核内的β-catenin含量升高。β-catenin在细胞核内与双向转录因子TCF/ LEF结合，激活wnt蛋白目标基因的表达[7]。Wnt/β-catenin信号通路高度保守，参与调节各种细胞的活动，在生长发育过程中起着关键作用[9]。

2 Wnt/β-catenin信号通路抑制剂

Wnt/β-catenin信号通路抑制剂包括两大类，一类是分泌型卷曲蛋白相关蛋白家族(secreted frizzled-related protein family，sFRPs)以及wnt抑制因子1(wnt inhibitory factor-1，WIF-1)，其中sFPR3是其代表，这类抑制剂主要与wnt蛋白结合以影响wnt蛋白与受体结合的能力。另一类是DKK(dickkopf)家族，主要通过与LRP5/6结合来影响Wnt/β-catenin信号通路，它还和骨性关节炎发生的风险密切相关[10]。硬化蛋白(sclerostin , SOST)和DKK1蛋白(dickkopf-1)能与wnt蛋白的受体LRP5/6结合，从而抑制wnt蛋白与LRP5/6的结合和信号传导。其机制可能是硬化蛋白和DKK1均结合至LRP5/6的第一个β螺旋，使wnt-1的信号传导受到抑制；DKK1还能结合到LRP5/6的第三个β螺旋以抑制wnt3a的信号传导[7,11]。

3 骨性关节炎中的Wnt/β-catenin信号通路

在人类OA遗传基因研究中，与Wnt/β-catenin信号通路相关的基因突变常常被认为是OA的重要易感基因。编码sFRP3的基因sFrp3中羧基末端arg324gly发生替换后，可导致承重关节OA发生率增加[12-13]。Nakamura等[14]在OA患者关节软骨、骨和滑膜组织的基因检测中发现，与wnt基因相关的wnt7b在OA发病过程中发挥重要作用。Blom等[15]发现WISP-1(Wnt1诱导信号通路蛋白1)表达在OA患者的组织标本和小鼠动物模型均出现升高。此外，在OA患者体内，Wnt/β-catenin通路的拮抗剂DKK1在血浆和滑液中的表达水平均较正常人群明显降低，且与OA影像学分级的严重程度呈负相关关系[16]。

Chan等[17]发现在小鼠和羊的OA动物模型以及OA 患者的软骨中，Wnt/β-catenin通路的抑制剂-硬化蛋白的表达升高。在OA动物模型的软骨移植治疗中，使用硬化蛋白能抑制Wnt/β-catenin信号通路的传导，其原理可能是通过降低Mmp、Adamts、Acan和Col2a1基因的表达，进而降低IL-1α介导的聚糖蛋白溶解以实现抑制分解代谢。相反，在OA动物模型发生骨硬化的区域中，硬化蛋白显著减少。因此，硬化蛋白在骨赘形成过程中的表达反映了其在抑制Wnt/β-catenin通路介导的软骨下骨形成过程的调节机制[18]。

在目前关于OA的研究中，采用了很多不同的动物造模技术，包括自发、手术、化学诱导以及基因敲除等。在自发OA的小鼠(str/ort小鼠)和胶原酶诱导OA的小鼠模型中，其关节软骨和滑膜中的Wnt基因以及其相关基因的表达水平均发生明显变化。例如，WISP1的表达水平显著升高，WISP1具有调节软骨细胞和巨噬细胞中MMPs和聚集酶表达的作用，并可诱导关节软骨的降解[15]。此外，sfrp3基因敲除的小鼠更容易被手术或化学诱导而出现OA表型[19-20]。同时，sfrp3在软骨细胞成熟和长骨发育的调节过程中还发挥着重要作用[21]。上述结果均表明了Wnt/β-catenin信号通路的激活在OA发生和进展过程中具有重要意义。

基于OA小鼠模型探究Wnt/β-catenin信号通路在OA病理生理过程中的作用是十分重要的。在β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠模型中，β-catenin外显子3被敲除后，使其产生稳定融合蛋白，对GSK-3β磷酸化以及随后的泛素化和蛋白酶体的降解都具有抑制作用。由于β-catenin的降解被抑制，导致了关节软骨细胞核内的β-catenin水平升高，从而导致出现关节软骨的逐渐减少和骨赘的形成等OA表型。在β-catenin(ex3)Agc1CreER小鼠模型中，同样出现了类似的情况。Zhu等[2]证实了β-catenin在胞内表达水平过高可导致关节软骨出现OA表型 。反之亦然，β-catenin在胞内水平过低也会导致关节软骨出现OA表型。TCF抑制剂(ICAT)是一种通过结合β-catenin特定结构，进而抑制β-catenin与核内TCF相互作用的细胞内蛋白。在Col2-ICAT转基因小鼠模型中，β-catenin信号通路在软骨细胞中被特异性抑制，导致生长板软骨细胞发育缓慢以及关节软骨退变[22-23]。这一系列的发现都表明，Wnt/β-catenin信号通路在OA发展过程中发挥了关键作用，维持正常的软骨细胞功能需要胞内的β-catenin处于稳定而适当的水平，过高或过低的β-catenin水平均会导致OA的发生与发展。

在OA病变初期，均会出现软骨细胞代谢率降低以及软骨细胞的肥大和凋亡[24]。此时，关节软骨细胞内显示软骨特异性的基因，如Col2a1和aggrecan等均出现表达水平降低；反映细胞肥大的标记基因如Runx 2和Col10a1等均出现表达升高；编码分解代谢酶的基因，如Mmp13、Adamts4和Adamts5等均出现表达升高[25-26]。软骨细胞中代谢组分合成的减少，分解代谢酶合成的增加，最终导致进行性软骨纤维化和退化。软骨下骨改变和骨赘形成均可出现在OA的进展过程中，通过调控Col2a1或Agc1基因的表达，条件性激活β-catenin信号的转基因小鼠可出现严重的软骨退变、软骨下骨侵蚀和骨赘形成[6]。上述研究证明了软骨细胞中表达的wnt和β-catenin相关蛋白可引发不同的细胞反应，直接或间接的影响OA表型的出现。

4 脊柱小关节骨性关节炎中的Wnt/β-catenin信号通路

在β-catenin(ex3)Col2CreER转基因小鼠模型和β-catenin(ex3)Agc1CreER转基因小鼠模型中，对2周龄的实验小鼠应用他莫昔芬，在3个月、6个月和9个月时对小鼠模型的脊柱小关节进行评估，结果发现在每一个时间节点上，小鼠的脊柱小关节均出现明显的退变。组织学分析显示，脊柱小关节OA和椎间盘退变是同时发生的[27]。上述研究证实，调控Wnt/β--catenin信号通路可诱导脊柱小关节OA和椎间盘退变。

MMP13是参与软骨降解过程中最重要的金属基质酶之一，而在OA患者的软骨细胞中MMP13亦呈现高表达[25]。Neuhold等[28]发现在Mmp13基因过表达的小鼠中可出现关节软骨退变的症状。Wang等[29]在Mmp13条件性基因敲除小鼠模型中发现，关节软骨体积和软骨基质分泌增加，软骨细胞凋亡减少；应用特定的MMP13抑制剂可减轻OA表型的严重程度。同时进一步敲除β-catenin基因外显子3和Mmp13基因，可获得双突变的β-catenin(ex3)/Mmp13Col2CreER小鼠模型，表现为β-catenin高表达和Mmp13缺失。在此类小鼠模型中发现，由β-catenin条件性激活所导致的关节退变以及退变产生的疼痛均得到显著缓解，进一步证实MMP13在脊柱小关节骨性关节炎的退变中具有关键的效应。在β-catenin(ex3)Col2CreER|Adamts5-/-双突变小鼠中，Wang等观察到了类似的脊柱小关节退变的缓解效应[27,30]。Mmp13或Adamts5的缺失可显著逆转β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠的脊柱小关节和椎间盘退变。ADAMTS蛋白酶家族在OA进程中具有促进蛋白聚糖和聚蛋白聚糖消耗的作用。在β-catenin(ex3)Col2CreER小鼠模型中，β-catenin过量表达可导致椎间盘组织Adamts4和Adamts5基因的表达亦出现升高。在OA小鼠模型中，敲除Adamts5基因或双敲除Adamts4和Adamts5基因的可有效防止软骨退化[26,31]。上述研究提示在基因水平上对金属基质酶等进行调控，可为脊柱小关节骨性关节炎的未来治疗策略奠定理论基础。

5 小结

随着对骨性关节炎研究的深入，其发生和发展过程日益得到重视。脊柱小关节骨性关节炎作为骨性关节炎中的典型代表之一，其发病机制与其他类型的骨性关节炎十分类似，如软骨退变、软骨下骨塌陷和骨赘形成等。目前，关于脊柱小关节骨性关节炎的研究广泛涉及生物力学、分子生物学等方面。Inoue等[32]通过观察脊柱小关节在不同负荷条件下的生物力学功能，提出了脊柱小关节骨性关节炎的诱因和疼痛的新解释。Nakamura等[33-34]通过对脊柱小关节骨性关节炎软骨进行高通量miRNA筛选，发现miR-181a-5p和miR-4454与脊柱小关节骨性关节存在相关性，进一步证实miR-181a-5p能通过促进软骨细胞凋亡和分解代谢使小关节面软骨变性、退变。Chen等[35]运用生物信息学方法发现Wnt/β-catenin信号通路深度参与脊柱小关节退变的病理生理过程。Wnt/β-catenin信号通路在骨性关节炎的病理生理过程中具有重要作用，其相关蛋白参与骨性关节炎的各种调节机制。然而，Wnt/β-catenin信号通路是如何激活的，是否还受到其他因素的调节，以及其如何参与软骨细胞、破骨细胞及成骨细胞的重塑机制等问题尚未完全明确，这也将是未来需要继续探索的重要方向之一。