心脏移植术后血液免疫监测研究进展*

柴军武 王 凯 孔祥荣

天津市第一中心医院心血管外科 300110

尽管机械循环辅助不断完善与发展，心脏移植仍然是终末期心脏病患者的长期治疗首要选择，心脏移植术后患者可获得良好的生活质量。心内膜心肌活检(EMB)是心脏移植术后排斥反应监测的金标准。然而，由于EMB检测的有创性，极大地限制了移植术后免疫抑制程度的监测，这样就造成无法科学应用免疫抑制药物，进而影响到排斥反应的发现，而过强的免疫抑制，又会造成感染的发生。经皮心肌内膜活检(EMB)用于评估心脏移植后排斥反应已经有45年的历史，其最初局限于急性细胞排斥反应(Acute cellular rejection,ACR)的评估，但近年来，对供体特异性抗体导致急性抗体介导的排斥反应(Acute antibody-mediated rejection,AMR)的作用有了越来越多的认识，AMR患者可能比ACR预后更差[1], 近年来，EMB作为排斥反应的诊断金标准逐步形成共识，然而，EMB仍然有很大的局限性。其侵袭性与手术可能的并发症风险有关，包括三尖瓣损伤、心肌穿孔和冠状动脉瘘的发生。即使经验丰富的病理专家也可能由于取样误差，无法评估更深的心肌组织，在同一患者不同标本之间在组织学解释上也缺乏一致意见，使得该技术的敏感性也有限。然而，活检仍然是监测和诊断急性排斥反应的金标准。基因表达谱(GEP)的引入可减少了许多患者需要进行活组织检查的次数，而目前大多数中心仍将EMB作为最初6～12个月监测的主要方法[2]。目前主要血液系统检测有以下几个方面。

1 基因表达谱

最近，有研究将分子技术用于评估活检心肌内的基因表达谱来提高诊断率。目前已开发了一种基于微阵列的系统来评估EMB标本(The Molecular Microscope)。该系统确定了与AMR相关的不同转录本，包括自然杀伤细胞转录本、巨噬细胞转录本、内皮激活转录本以及与国际心肺移植学会(ISHLT)病理抗体介导的排斥反应分级密切相关的干扰素转录本。这项技术提高了从单个活检组织进行排斥诊断的可能性，开启了自动化的可能性，并提供了定量结果。虽然这些进展可提高EMB诊断率，但非侵入性的基于血液的检测来评估移植排斥反应可能降低成本和并发症，并允许更频繁地检测来评估抗排斥治疗的反应[3]。

2 供体特异性抗体

移植时供体特异性抗体(DSA)的存在和移植后新生DSA的发展都与移植后不良反应有关，包括排斥反应、移植心脏血管病变和移植物失功。即使移植后受者的近1/3存在DSA，但DSA的存在并不一定预测AMR的发展。目前ISHLT指南建议移植后1、3、6和12个月时常规监测抗人白细胞抗原 DSA[4-5]。近年来，非HLADSA的研究越来越多，已发现与急性和慢性同种异体排斥反应有关。检测到的抗原包括主要组织相容性Ⅰ类相关基因A (MICA)、血管紧张素Ⅱ型1受体(ATIR)、内皮素A型受体内皮细胞抗原、波形蛋白(vimentin)、胶原-Ⅴ和非HLA IgM抗体[6]。有证据表明，抗内皮抗体与AMR和移植心脏血管病变的发生发展有关。新生HLA DSA联合AT1R抗体的发展可能对移植后心脏移植排斥反应的发展有害[7]。目前，这些抗体在急性和慢性排斥反应中的检测仍在研究中。非HLA抗体在介导同种异体心脏损伤中的临床意义和作用尚不明确。

3 组织损伤和心脏功能的标记物

许多与微血管血栓形成相关的早期生物标志物(微血管纤维蛋白沉积、血管组织纤溶酶原激活物的消耗、内皮激活和血管抗凝血酶的丢失)以及血清心肌肌钙蛋白的检测和血清可溶性黏附分子水平的升高，都与后期移植心脏血管病变相关。在最近一篇评估心肌肌钙蛋白检测ACR的研究综述中，高灵敏度的肌钙蛋白检测确定具有高灵敏度(82%～100%)和高阴性预测值(97%～100%)[8]。

在一项前瞻性生物标志物研究中，评估与心肌细胞损伤(肌钙蛋白)、心功能(钠尿肽)、纤维化(Galectin-3和ST-2)和心肾功能(Cystatin-c)相关的生物标志物在心脏移植后10d与1年的结果[9]相关。只有胱抑素C和高敏感性肌钙蛋白T (hsTnT)可预测1年死亡率。此外，在心脏移植后1年左心室射血分数(LVEF)降低的患者中，这两个与半乳糖蛋白酶-3相关的生物标记物均升高。n末端b型利钠肽(NT-proBNP)未显示早期预后情况。在本研究中，没有测量到的生物标志物预测排斥反应，但至少发生排斥反应的患者心脏移植后12个月，hsTnT和NT-proBNP显著升高。许多研究表明，成人和儿童心脏移植受者中钠尿肽的绝对测量值和连续测量值的变化可以预测急性同种异体排斥反应[9-10]。

4 基因测序

第一个临床可用于评估心脏移植排斥反应的无创血液检测是利用基因测序(Gene expression profile GEP)。在对已知同种异体免疫途径和白细胞微阵列的分析中，252个候选基因被确定为实时聚合酶链反应(PCR)。在随后的一项较小的单中心研究(EIMAGE)中，对60名患者在移植后(55d)早期随机进行GEP或观察活检[11]。在排斥反应监测方面，GEP与EMB再次具有可比性，并且没有导致不良结果的增加。GEP也被证明有助于指导皮质类固醇的停止，在这方面与EMB相似。使用GEP (AlloMap)已被纳入ISHLT指南，用于心脏移植后患者的管理，并有助于减少用于监测排异反应的活体组织检查的数量[12]。

关于GEP的使用，有一些重要的注意事项。这项测试还没有在移植<55d的患者身上得到验证。如果患者每天服用> 20mg的强的松，则应避免使用(因为一些被检测的基因对类固醇有反应)。应避免在治疗排斥反应后21d内和输血后30d内进行该试验。重要的是，GEP还没有在抗生素耐药性患者中进行试验。因此，EMB仍然是移植后前3个月监测的首选测试，通常在第1个月每周进行1次，然后每2周进行1次。

5 游离DNA

细胞更新的一个不可避免的结果就是DNA释放到循环系统中。游离DNA (cfDNA)是从健康、炎症或病变组织中细胞凋亡或坏死细胞中重新释放的。循环cfDNA自70年前在人类血浆中发现以来，作为一种非侵入性的诊断生物标志物，已成为一个有价值的研究领域。在移植中，对移植受者血液中供体来源cfDNA (dd-cfDNA)的检测被认为是ACR和AMR损伤的无创标志物。单中心研究表明，心脏移植急性排斥反应后可检测到dd-cfDNA水平升高，且升高先于EMB的组织学排斥反应[13-14]。

最初的方法是使用全基因组测序来检测和量化cfDNA，但是分析的复杂性和成本最终限制了它作为临床有用工具的应用。一种更快速、更具成本效益的监测策略是对dd-cfDNA进行有针对性的定量，但这需要对移植供体进行基因分型，这是不切实际的。利用下一代测序对单核苷酸多态性进行靶向扩增，最近已被证实可以在不需要供体或受体的情况下量化移植受者的dd-cfDNA，基因分型结果[15]。在一项多中心回顾性病例对照研究中，这项技术已被证明可以检测心脏移植受者的ACR。在肾移植中，一项前瞻性的多中心试验证明了该技术在检测急性排斥反应中的有效性[16]。

6 T细胞免疫功能

移植受者的管理面临的挑战是平衡免疫抑制，一方面防止感染、恶性肿瘤和药物毒性等并发症，另一方面防止移植物急性或慢性排斥反应。单独的治疗药物监测不足以评价免疫反应，其重要价值是预防药物毒性。ImmuKnow试验检测CD4+T细胞介导免疫，并帮助识别有感染和排斥风险的患者。该实验在外周血中进行，测量活化淋巴细胞中三磷酸腺苷酶的释放，帮助预测免疫状态。它在评估肾、胰腺和小肠等实体器官移植的感染和排斥反应风险方面有一定作用。使用ImmuKnow试验[17]对来自10个美国中心的500多个实体器官移植受者(心脏、肾脏、肾胰、肝脏和小肠)进行了荟萃分析，从移植后不同时间的受者身上提取血样，并与临床过程进行比较。在这项分析中，39例经活检证实为细胞排斥和66例确诊发生感染。免疫应答值为25ng/ml ATP的受体发生感染的可能性是免疫应答较强的受体的12倍。同样，免疫反应为700ng/ml ATP的受体发生ACR的可能性是免疫反应值较低的受体的30倍。在中等免疫反应区，感染和排斥的比值曲线相交于280ng/ml ATP，这为实体器官接受者的免疫功能提供了一个免疫目标。在一项对近300名心脏移植受者的单中心研究中，在移植后2周～10年间共进行了864次免疫监测分析。感染病例38例，排斥病例8例。感染期间的平均免疫监测评分明显低于稳定状态(187ng/ml ATP VS 280ng/ml ATP,P<0.001)[18]。在临床上，该分析对确定活动性感染期间免疫抑制的程度最有用，如果免疫监测评分较低(特别是< 100ng/ml ATP)，则可指导减少免疫抑制。免疫抑制剂量受药物不耐受限制的患者，ImmuKnow可提供免疫抑制疗效的测定，而不限于治疗性药物监测。如果在无症状患者中进行该试验，由于感染风险高，如果ATP/ml得分< 100ng/ml ATP，则可提示免疫抑制的降低，如果得分升高(>700ng/ml ATP)，则可能需要考虑加强免疫抑制。

7 小结

有效的免疫抑制药物的应用促进了心脏移植作为治疗终末期心脏病的发展。然而，自移植手术开始以来，如何平衡免疫抑制以减少移植排斥反应、药物毒性、感染和恶性肿瘤一直是挑战。心肌损伤和功能的生物标志物可以提供更多的数据来帮助确定移植后的移植物功能。GEP用于临床，减少了对一些心脏移植受者进行活体组织检查以监测排斥反应的必要性。DSA监测有助于对存在AMR风险的患者进行风险分层，dd-cfDNA有助于在活检发现组织学变化前识别ACR和AMR风险患者。ImmuKnow试验在成人心脏移植受者临床中主要用于评估过度免疫抑制和感染风险。总之，随着分子技术的快速发展,移植术后监测将逐步完善。