基于纳米金/多孔硅基底的荧光标记法对生物分子的检测*

何蕾

(新疆大学 物理科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐830046)

0 引言

多孔硅是一种具有大的比表面积、良好的生物兼容性、易于功能化的新型纳米材料，可根据实际应用需要制备成具有不同光子晶体结构的光学器件，并作为良好的基底材料应用于生物传感器领域．和以往其他光素类衍生物相比，罗丹明类染料是生物技术中常用的蛋白质分析染料之一，它价格低廉、易于标记、结构高度刚化、光稳定性强、波长范围较宽、光产率高、p H敏感性低，做为光标记物可广泛应用于分子生物学、分子遗传学、医学等领域，可用于制备高灵敏度的光生物传感器[1-5]．纳米金因其具有表面等离子体共振效应，可增强其表面及附近的光物质的光发射强度[6-10]，这一特性被广泛应用于生物医学、光电器件等领域．此外，纳米金还具有易于链接生物的特性，从而增强生物传感器的稳定性，已被广泛应用于生物分子检测[11-14]．Zhang Miaorong等人利用纳米金的修饰增强了多孔硅的拉曼信号[15]，SHI Fugui等人利用纳米金增强了多孔硅中罗丹明的光信号[16]，LIYanyu等人利用量子点标记生物探针的方法进行生物分子检测[17]，但目前尚未见在纳米金修饰的多孔硅中采用罗丹明6G光标记法检测生物分子的报道．

本实验成功制备了纳米金修饰的多孔硅基底材料，利用纳米金的等离子体效应增强了多孔硅中光标记物的光信号，以提高光生物传感器的灵敏度，通过链接生物光探针后光信号强度的变化实现生物浓度检测，可实现低成本、易标记、稳定性好、灵敏度高的生物大分子的检测，其检测极限为121 nM．

1 实验材料及方法

1.1 实验材料

罗丹明6G染料分子的尺寸直径分布在7.5～8.5 nm之间，颜色呈橘红色，其光峰位置位于582 nm左右，激发波长为500 nm，如图1．

1.2 多孔硅器件的制备

电化学腐蚀法所用的硅片电阻率为1～7Ω· m，晶向为＜100＞，N型硅．腐蚀前先将硅片依次放入丙酮、酒精、去离子水中进行10 min超声清洗，以去除表面污染物，用40%HF和98%无水乙醇（体积比为3∶1）的混合溶液作为腐蚀液，用计算机控制腐蚀的电流和时间．本实验采用的电流及时间参数分别为J=30 mA· m-2，t=10 min，如图2所示多孔硅样品的孔径分布在500 nm左右，孔径尺寸较大的优越条件为之后纳米金的沉积、光标记分子进入、生物分子的检测提供了有利条件，图3为多孔硅样品的截面形貌图．

图1 激发光为500 nm的罗丹明6G的光致发光光谱Fig 1 Photoluminescence spectra of Rhodamine 6G at an excitation wavelength of 500 nm

图2 多孔硅样品的表面形貌图Fig 2 Surface morphology of porous silicon sample

图3 多孔硅样品的截面形貌图Fig 3 Cross-section morphology of porous silicon sample

腐蚀后样品在去离子水中清洗并在室温下干燥，放置在双氧水(30%)中80℃条件下氧化3 h．最后将样品浸没在甲醇和去离子水稀释后的氨丙基三乙氧基硅烷（去离子水∶甲醇∶APTES=10∶10∶1体积比）溶液中室温下1 h，以完成氨基化，为纳米金颗粒的沉积及后期样品醛基化提供基础条件．氨基化后，将样品在甲苯中清洗以除去未链接上的多余的APTES，并在100℃条件下烘烤10 min．

1.3 纳米金/多孔硅基底材料的制备

在多孔硅样品上沉积金纳米粒子的方法如下：在100 mL水中加入2 mL、0.1 mM的氯金酸溶液直至沸腾，之后快速加入4 mL（1.1 mM）柠檬酸三钠溶液，20 min后，停止加热并将溶液静置2 h，之后再将氨基化后的多孔硅样品在纳米金胶溶液中浸泡8 h，浸泡后样品在去离子水中清洗并在空气中干燥．纳米金颗粒的尺寸约为10 nm左右，本实验中制备的多孔硅样品的孔径约为500 nm，其尺寸大小为Au颗粒、RB分子及生物分子的进入提供了足够的空间．沉积金纳米颗粒后，将样品放入2.5%的戊二醛溶液中浸泡1 h使多孔硅表面完全被醛基修饰，取出后用PBS（p H=7.4）和去离子水反复冲洗，并干燥．

1.4 纳米金/多孔硅链接目标DNA

用PBS将目标DNA稀释为1.25μM、2.5μM、3.125μM、5μM、10μM五个浓度，将以上不同浓度的目标DNA分别用移液器滴加在多孔硅样品上，放入37℃恒温箱中2 h，取出后用PBS冲洗，N2中干燥．再放入3 M的EA中浸泡，放置37℃恒温箱中1 h，取出后用HEPES（p H=9）缓冲液彻底冲洗．

1.5 Rh6G对探针DNA的标记

20个碱基的DNA分子尺寸约6 nm，采用PBS缓冲液将生物探针DNA浓度调整为10 mg/mL，取5 mL生物探针分子溶液置于10 mL小烧杯内，将2 mL Rh6G溶液(5×10-4M)立即缓慢滴加于生物探针分子溶液内，边加边轻搅，其后避光震荡室温下反应3 h．为检测DNA特异性反应，实验中分别标记互补DNA探针1和非互补DNA探针2．如图4所示，Rh6G光位于582 nm，在探针DNA和Rh6G偶联后，Rh6G-DNA溶液的光峰移动到587 nm，发光峰移动了5 nm，表示Rh6G成功标记了探针DNA分子，光强度的减弱可能是因为Rh6G标记后浓度减小，也可能是生物分子的猝灭作用，偶联后Rh6G-DNA发光光谱仍然较窄，说明偶联后的Rh6G-DNA分散性仍然较好．

图4 Rh6G与Rh6G+DNA荧光谱对比图Fig 4 The fluorescence spectra of Rh6G and Rh6G+DNA

1.6 目标DNA和探针Rh6G-DNA杂交反应

取50μL Rh6G-DNA溶液滴加到已经链接目标DNA分子的多孔硅表面，37℃恒温反应2 h，使DNA充分杂交反应，然后取出用PBS和DI反复冲洗以去除未反应完全的DNA，N2中干燥．

2 样品的检测

3 分析与讨论

3.1 Au纳米颗粒有效增加荧光染料分子荧光信号的分析

图 5 (1)多孔硅本身的荧光(黑色)；(2)链接10 μM的生物分子的多孔硅样品链接生物探针后的荧光(红色)；(3)链接10μM的生物分子的Au/多孔硅链接生物探针后的荧光(蓝色)Fig 5 (1)Fluorescence of porous silicon(black);(2)Fluorescence of porous silicon with biological probes(10μM)(red);(3)Fluorescence of Au/porous silicon with biological probes(10μM)(blue)

3.2 DNA的特异性反应及互补DNA浓度的检测

图6为Au/多孔硅上目标DNA和Rh6G-DNA杂交反应后的光光谱图．其中红色线为10μM目标DNA与非互补的光标记生物探针反应后的光谱图，可见非互补的光标记生物探针由于不能发生杂交反应，而未链接至多孔硅中，因此其无光峰．采用此方法可有效检测生物分子是否可发生特异性反应，图中其余谱线分别为不同浓度的目标分子与互补光标记生物探针分子发生杂交反应的光谱图．由图可见反应后光峰在565 nm附近，这可能是因为加入的纳米Au的负介电常数性质使Rh6G原有的582 nm的峰位移至565 nm附近，也可能是因为链接生物后Rh6G粒子间极偶相互作用受到影响，从而使光峰蓝移．图中565 nm位置对应的光谱峰的强度与加入的目标生物分子的浓度成正比，因此，光信号的强弱可直接反映出目标生物分子浓度大小，即可成功实现对目标生物分子浓度的检测．

图6 Au/多孔硅上不同浓度的目标DNA和Rh6GDNA探针杂交反应后的荧光光谱图Fig 6 Fluorescence spectra of Au/porous silicon at different concentrations Rh6G-DNA after hybridization

图7 检测目标DNA浓度从1.25μM到10μM的线性拟合关系图Fig 7 The linear fitting diagram of the detection target DNA concentration from 1.25μM to 10 μM

图7为检测目标DNA浓度从1.25μM到10μM的线性拟合关系图，线性回归方程是Y=24.1+8.25X，其中Y是光强度值，X代表目标DNA生物分子浓度．利用计算机软件Origin进行拟合，拟合系数为0.996 84，拟合度非常高．光仪的分辨率为0.1，因此该生物传感器的检测限为0.1/(8.25/μM)=121 nM．

4 结论

本实验成功制备了纳米金修饰的多孔硅生物传感器基底材料，将不同浓度的目标DNA链接至Au/多孔硅基底，再链接罗丹明6G标记的生物探针分子，利用纳米金的等离子体效应有效增强了链接到多孔硅中的光标记生物探针的光信号．根据链接光探针后多孔硅光信号强度的变化，实现对DNA分子特异性反应的检测．通过分析目标DNA分子的浓度对光信号强度的影响，可表征互补DNA生物分子的浓度，其检测限为121 nM，对生物大分子实现了低成本、易标记、稳定性好、灵敏度高的检测．